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研究目的:宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一,新的生物标志物的探索对于宫颈癌的早期诊断以及精准治疗是非常必要的。本研究旨在从临床层面探讨宫颈癌的miRNAs表达谱并筛选兴趣miRNA,然后从体外细胞水平以及体内动物实验来对宫颈癌的机制进行研究,从而为宫颈癌的诊断以及精准治疗提供理论和实验依据。研究方法:1.送检样本进行miRNA芯片分析;用q RT-PCR验证miR-433的表达;通过miRNAs相关数据库预测差异表达miRNAs相关的信号通路;提取样本DNA并进行miR-433启动子区甲基化检测。2.体外培养人宫颈癌Ca Ski细胞并将细胞分为四组,分别为control组、甲基化抑制剂组(5-AZA)、miR-433过表达组以及miR-433抑制剂组,然后检测miR-433的水平,同时采用MTT检测细胞0h、24h、48h以及72h细胞活力。3.采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;traswell实验检测细胞的侵袭能力改变;提取细胞蛋白并用试剂盒检测caspase3和caspase9活性;western blot检测凋亡相关蛋白(MDM2、Bax以及p53的表达)以及PI3K、p-AKT/AKT和FAK的表达;细胞免疫荧光检测FAK在细胞中的定位和表达。4.确定miR-433的靶向关系后在细胞中转染FAK过表达质粒,然后用western blot检测上述相关的蛋白表达;transwell实验检测细胞侵袭能力改变;流式细胞术检测细胞凋亡情况。5.为了进一步确定PI3K/AKT通路介导miR-433在宫颈癌细胞中的作用,采用PI3K抑制剂(GDC-0032)处理细胞,然后检测上述相关蛋白的表达;transwell实验检测细胞侵袭能力改变;流式细胞术检测细胞凋亡情况。6.将40只Balb/C裸鼠分为四组,每组10只,其中一组为对照组(不建立Ca Ski裸鼠移植瘤模型)、其余三组为裸鼠移植瘤模型组,分别为scramble组(生理盐水注射组)、miR-433过表达组(mimics转入Ca Ski细胞并注射)以及miR-433干扰组(inhibitor转入Caski细胞并注射)。7.记录小鼠的体重变化及死亡情况,根据小鼠的死亡时间绘制生存曲线;颈椎脱臼法处理各组小鼠,完整剥离瘤体,检测组织中miR-433的水平;同时采用免疫组化的方法检测各组肿瘤组织中PI3K、p-AKT和FAK的表达。研究结果:1.miRNA芯片显示与对照组相比,宫颈癌组中有16个miRNAs表达升高,12个miRNAs表达降低,其中下降的miRNAs中miR-433差异最大;通过DIANA-miRPath预测的差异表达miRNAs相关的信号通路中PI3K-Akt信号通路涉及的miRNAs最多。2.与对照组相比,miR-433启动子区甲基化水平在宫颈癌组中升高,且III-IV期患者中的表达水平高于I-II期患者;相关性分析显示miR-433的表达水平与启动子区甲基化水平呈负相关(R~2=0.7177)。3.与对照组细胞相比,5-AZA和miR-433处理组细胞活力明显降低(P<0.05)、细胞凋亡比例明显升高(P<0.05)、细胞侵袭能力降低(P<0.05),同时细胞中caspase3和caspase9的活性升高(P<0.05)。4.与对照组细胞相比,MDM2在5-AZA和miR-433处理组细胞中表达降低,而Bax和P53则表达升高,说明5-AZA和miR-433促进了细胞的凋亡(P<0.05);同时,PI3K/AKT/FAK在5-AZA和miR-433处理组细胞中表达降低(P<0.05),即抑制了PI3K/AKT通路的激活及靶基因FAK的表达。5.在细胞中过表达FAK后,MDM2表达升高(P<0.05),P53和Bax表达降低(P<0.05),同时,细胞凋亡比例降低(P<0.05),细胞侵袭能力升高(P<0.05)。用PI3K抑制处理细胞后,MDM2表达降低(P<0.05),而P53和Bax表达升高(P<0.05);同时,细胞凋亡比例升高(P<0.05),细胞侵袭能力降低(P<0.05)。6.与control组小鼠(不接种移植瘤)相比,移植瘤模型组小鼠体重均下降,且inhibitor组小鼠体重下降最明显(P<0.05);生存分析显示mimics组小鼠的生存时间及生存率优于inhibitor组小鼠(P<0.05)。7.与scramble组小鼠相比,mimics组小鼠剥离的肿瘤尺寸降低,而inhibitor组小鼠剥离的肿瘤尺寸升高;同时,PI3K、AKT和FAK在mimics组小鼠肿瘤组织中表达降低,而在inhibitor组小鼠肿瘤组织中表达升高。结论1.miR-433在宫颈癌患者中低表达,且miR-433启动子区甲基化能够抑制miR-433的表达。2.5-AZA和过表达miR-433能够通过抑制PI3K/AKT/FAK通路促进宫颈癌细胞凋亡、抑制细胞侵袭以及降低细胞增殖。3.miR-433高表达的宫颈癌细胞移植瘤小鼠具有更长的生存时间和更高的生存率。