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水稻条纹叶枯病是水稻生产上的一种重要病毒病害。该病是由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起,由介体灰飞虱（Lapdelphax striatellus,SBPH）以持久循回方式经卵传播,引起水稻大面积减产,造成巨大经济损失。RSV是一种负义单链RNA病毒,其基因组由4条单链RNA组成,总共编码7个蛋白。其中RNA3链采用负义编码策略,编码2个蛋白,其正义编码一个大小为23.9 kDa的非结构蛋白p3,被鉴定为基因沉默抑制子。p3通过特异性识别并结合双链或单链siRNA,阻止其进入到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）中,从而抵抗寄主的基因沉默。目前关于影响p3蛋白功能的寄主蛋白还鲜有报道。本研究在前期工作中,利用酵母双杂交系统（Yeast two hybrid system,YTHS）从水稻cDNA文库中筛选到一个与RSV p3互作的水稻类泛素蛋白5,命名为OsUBL5。通过酵母双杂交（Yeast two hybrid,Y2H）、双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验进一步证实两者的相互作用。为明确OsUBL5在RSV侵染过程中的作用,根据RSV可以在实验条件下摩擦接种至本氏烟,因此先在本氏烟上开展工作。由OsUBL5氨基酸序列比对到3条同源的NbUBL5序列,序列分析发现,OsUBL5与这3条序列的氨基酸相似性达98%。采用Y2H,BiFC和Co-IP方法证明了3个同源的NbUBL5也与p3存在相互作用。接下来,分析不同物种UBL5氨基酸序列发现,其存在多个保守氨基酸位点。基于此,依次突变其保守氨基酸位点,通过Y2H和BiFC实验证实UBL5的D64和N7位氨基酸是其与p3互作的关键位点。为了明确UBL5与p3互作对于RSV侵染的生物学意义,首先,基于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默体系,构建本氏烟NbUBL5s基因的沉默载体,系统沉默本氏烟NbUBL5s。在NbUBL5s基因下调约85%时,植株系统叶出现轻微腿绿、黄化表型,植株稍微矮化;摩擦接种RSV后,分析NbUBL5s沉默对RSV侵染的影响。结果发现,NbUBL5s沉默植株接种叶RSV侵染斑点数明显增多,病毒积累量显著增加,表明NbUBL5s的沉默促进RSV侵染。此外,qRT-PCR发现RSV侵染可以诱导OsUBL5s和NbUBL5s基因的上调表达。通过农杆菌介导的遗传转化获得3个稳定过表达NbUBL5基因的本氏烟株系,摩擦接种RSV发现,过表达NbUBL5基因植株与野生型没有明显的生长发育表型差异,但是转基因植株接种叶和系统叶RSV发病更慢,RSV症状更轻,且病毒积累量均比野生型少,说明过表达NbUBL5的本氏烟植株对RSV产生一定的抗性。同样地,我们也获得了RSV自然寄主水稻过表达OsUBL5的转基因植株,转基因植株生长发育也没有显著差异;带毒灰飞虱取食健康植株后,转基因植株发病率和死亡率均比野生型低,RSV积累量显著减少;说明转OsUBL5基因水稻植株同样表现了对RSV的抗性。综上结果表明,水稻和本氏烟UBL5参与了对RSV侵染的抗病应答。p3作为RSV的一个重要沉默抑制子,其对于病毒成功侵染是至关重要。因此,通过瞬时表达进一步分析NbUBL5与OsUBL5的表达分别对p3沉默抑制子功能的影响。结果发现,NbUBL5和OsUBL5在转GFP的16c本氏烟上表达均能抑制p3的沉默抑制子功能,且p3蛋白的积累量显著降低;同时,在野生型本氏烟上也分别表达NbUBL5和OsUBL5对p3蛋白的影响,结果发现,p3蛋白积累量也明显减少,说明OsUBL5和NbUBL5能够降解p3,进而影响其沉默抑制子功能。互作缺陷的NbUBL5突变体D64对p3功能实验表明,NbUBL5对p3的降解依赖于两者的相互作用。接下来,为了明确UBL5降解p3的机制。基于UBL5是一个类泛素蛋白,属于泛素蛋白家族成员之一,具有与泛素高度保守的空间结构。因此,利用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理已共浸润p3和NbUBL5或OsUBL5的叶片,结果发现MG132处理抑制了UBL5对p3的降解;说明UBL5是通过26S蛋白酶体降解p3。泛素/类泛素分子能够被26S蛋白酶体的受体亚基RPN10和RPN13识别,这是经典的泛素-蛋白酶体系统。因此,通过Y2H,BiFC和Co-IP实验证实NbUBL5.1与NbRPN10或NbRPN13存在相互作用,以及OsUBL5与OsRPN10或OsRPN13互作。分别在沉默NbRPN10或NbRPN13的本氏烟上,共浸润p3和NbUBL5发现,p3的降解在沉默植株上得到一定程度缓解;这些结果表明,UBL5介导p3降解依赖于与泛素受体RPN10或RPN13的相互作用。综上实验结果,本研究鉴定到一个与p3互作的寄主蛋白UBL5,并明确了UBL5介导p3的降解依赖于26S蛋白酶体,且UBL5与p3互作是影响p3沉默抑制子功能必需的,参与植物抗RSV侵染的作用机制。这对于深入理解RSV与寄主蛋白、植物抗病与病毒致病之间的关系具有重要的参考价值,为拓宽寄主抗病途径提供了理论依据。