论文部分内容阅读
目的:本实验通过研究PMOP模型大鼠骨髓线粒体氧化应激相关蛋白,以及左、右归丸对PGC-1α信号通路的影响,从骨髓线粒体氧化应激的角度探讨肾之“阴阳互济”法调控PMOP骨代谢稳态的机制,为左、右归丸防治PMOP提供新的理论依据。材料与方法:SPF级2月龄SD雌性未生育大鼠90只,随机分为假手术组（SHAM组）、模型组（OVX组）、左归丸组（ZGW组）、右归丸组（YGW组）、补佳乐组（BJL组）,每组18只。采取双侧卵巢切除术建立PMOP模型,SHAM组采取在卵巢周围摘除等大小的脂肪组织。适应性喂养3d后,灌胃给药1d/次,灌胃12W,末次灌胃禁食12h后取材。麻醉后,腹主动脉取血、静置、离心、冻存-80℃;取右侧股骨、胫骨,剔除肌肉、筋膜组织,用PBS冲洗骨髓腔至骨干发白,骨髓组织离心后弃上清,冻存-80℃;取左侧股骨,剔除肌肉、筋膜组织,置于4%多聚甲醛4℃固定;取左侧股骨,剔除肌肉、筋膜组织,湿纱布包裹,冻存-80℃。采用Micro-CT检测大鼠左侧股骨远端骨量参数;采用苏木素-伊红染色（HE）法检测大鼠左侧股骨远端骨组织形态;采用免疫组织化学染色法检测左侧股骨远端骨髓组织FABP4表达;采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清BALP、SOD、ATP浓度;采用比色法检测大鼠血清TRACP、线粒体呼吸链Ⅰ、Ⅱ酶浓度;采用Mito Sox Red染色法检测骨髓中ROS表达;采用western-blot法检测骨髓中LEP、FABP4、Adipoq、PPAR-γ、UCP1、PGC-1α蛋白表达及骨髓线粒体Cyt C、COX1、ATP5α1蛋白表达。结果:1.左、右归丸对PMOP模型大鼠的影响1.1左、右归丸对PMOP模型大鼠骨组织结构及形态学的影响Micro-CT检测大鼠左侧股骨远端结果:与SHAM组相比,OVX组BMD、Tb.Th、BV/TV、Ct.Th降低（P＜0.01或P＜0.05）、Tb.Sp升高（P＜0.01）,在形态上,骨小梁间隔增加、面积减少。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组BMD、Tb.Th、BV/TV、Ct.Th升高（P＜0.01或P＜0.05）、Tb.Sp降低（P＜0.01或P＜0.05）,在形态上,骨小梁厚度增粗、紧密且均匀。与BJL组相比,三个用药组无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组BMD、BV/TV、Ct.Th略优与YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。HE染色法观察左侧股骨远端形态学显示:SHAM组可见皮质骨和松质骨结构完整,骨髓腔内脂肪大小、数目正常。OVX组可见松质骨内骨小梁数目减少且稀疏、皮质骨有空隙、变薄且脆,骨髓腔内可见较多圆润的脂滴结构,脂肪细胞数量增多、体积增大导致脂肪细胞占总骨髓面积增加。ZGW组可见松质骨内骨小梁数目相对增多且密集、皮质骨相对较厚,骨髓腔内脂肪细胞数量相对减少,体积较小,脂肪细胞占总骨髓面积较少。YGW组可见骨髓脂肪细胞数目减少,骨小梁数目增加。BJL组可见皮质骨厚度增加、骨小梁数目增加、脂肪细胞数目减少。1.2左、右归丸对PMOP模型大鼠血清BALP、TRACP含量的影响ELISA法检测血清BALP含量结果:与SHAM组相比,OVX组血清BALP含量升高（P＜0.01）,与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组血清BALP含量下降（P＜0.01）;与BJL组相比,ZGW、YGW组血清BALP含量相对下降（P＜0.01）。与YGW组相比,ZGW组血清BALP含量优于YGW组（P＜0.01）。比色法检测血清TRACP含量结果:与SHAM组相比,OVX组血清TRACP含量升高（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组血清TRACP含量下降（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组血清TRACP含量相对下降（P＜0.05）。与YGW组相比,ZGW组血清TRACP含量略优于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。2.左、右归丸对PMOP模型大鼠骨髓组织脂肪积累的影响2.1左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织蛋白FABP4表达的影响免疫组化法检测左侧股骨远端显示:SHAM组可见骨髓腔内脂肪组织体积适中且均匀,仅有少量棕黄色表达,其阳性率为9.43%。OVX组可见骨髓腔内脂肪组织数量较多,体积较大,在皮质骨和松质骨内均有较深的棕黄色表达,阳性率为21.20%。ZGW组可见骨髓腔内脂肪组织棕黄色染色稍减,阳性率为17.10%。YGW组可见骨髓腔内脂肪组织棕黄色染色稍减,阳性率为12.75%。BJL组可见皮质骨和骨髓腔内均有棕黄色表达,阳性率为15.26%。WB实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓FABP4蛋白表达上升（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓FABP4蛋白表达下降（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW组骨髓FABP4蛋白表达上升（P＜0.05）,YGW组骨髓FABP4蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组FABP4蛋白表达上升（P＜0.05）。2.2左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织LEP蛋白表达的影响实验结果显示:与SHAM组相比,骨髓LEP蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓LEP蛋白表达上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW和YGW组LEP蛋白表达下降（P＜0.01）。与YGW组相比,ZGW组骨髓LEP蛋白表达略优于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。2.3左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织PPAR-γ蛋白表达的影响实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓PPAR-γ蛋白表达上升（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓PPAR-γ蛋白下降（P＜0.01或P＜0.05）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓PPAR-γ蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓PPAR-γ蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。2.4左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织Adipoq蛋白表达的影响实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓Adipoq蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓Adipoq蛋白表达上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓Adipoq蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓Adipoq蛋白表达略优于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。2.5左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织UCP1蛋白表达的影响实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓UCP1蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓UCP1蛋白表达上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓UCP1蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓UCP1蛋白表达略优于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。2.6左、右归丸对PMOP大鼠骨髓组织PGC-1α蛋白表达的影响实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓PGC-1α蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓PGC-1α蛋白表达上升（P＜0.01或P＜0.05）。与BJL组相比,ZGW组骨髓PGC-1α蛋白下降（P＜0.01）;YGW组骨髓PGC-1α蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓PGC-1α蛋白表达略弱于YGW组（P＜0.05）。3.左、右归丸对PMOP模型大鼠骨髓线粒体氧化应激的影响3.1左、右归丸对PMOP模型大鼠血清ATP、SOD,骨髓线粒体ROS含量的影响ELISA法检测血清ATP含量结果:与SHAM组相比,OVX组血清ATP含量下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组血清ATP含量上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组血清ATP含量相对下降（P＜0.01或P＜0.05）。与YGW组相比,ZGW组血清ATP含量弱于YGW组（P＜0.05）。ELISA法检测血清SOD含量结果:与SHAM组相比,OVX组血清SOD含量下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组血清SOD含量上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组血清SOD含量相对下降（P＜0.01）。与YGW组相比,ZGW组血清SOD含量弱于YGW组（P＜0.01）。Mito-Sox法检测骨髓线粒体ROS含量结果:与SHAM组相比,OVX组骨髓线粒体ROS含量显著增加（P＜0.05）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓线粒体ROS含量显著降低（P＜0.05）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓线粒体ROS含量无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体ROS含量略优于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。3.2左、右归丸对PMOP模型大鼠骨髓线粒体呼吸功能的影响3.2.1左、右归丸对PMOP模型大鼠骨髓线粒体Cyt C、COX1、ATP5α1蛋白的影响WB法检测骨髓线粒体Cyt C蛋白实验结果显示:与SHAM组相比,OVX组骨髓线粒体Cyt C蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓线粒体Cyt C蛋白表达上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW组骨髓线粒体Cyt C蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）,YGW组骨髓线粒体Cyt C蛋白表达优于BJL组（P＜0.01）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体Cyt C蛋白表达弱于YGW组（P＜0.01）。WB法检测骨髓线粒体COX1蛋白实验结果显示:与SHAM组相比,骨髓线粒体COX1蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓线粒体COX1蛋白表达升高（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓线粒体COX1蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体COX1蛋白表达略弱于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。WB法检测骨髓线粒体ATP5α1蛋白实验结果显示:与SHAM组相比,骨髓线粒体ATP5α1蛋白表达下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW、YGW、BJL组骨髓线粒体ATP5α1蛋白表达升高（P＜0.01或P＜0.05）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓线粒体ATP5α1蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体ATP5α1蛋白表达略弱于YGW组,但无统计学意义（P＞0.05）。3.2.2左、右归丸对PMOP模型大鼠骨髓线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ酶活性的影响比色法检测骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性含量结果:与SHAM组相比,OVX组骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性显著下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW组骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性略微上升（P＞0.05）,YGW、BJL组骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性显著上升（P＜0.01）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性显著下降（P＜0.01）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体复合物Ⅰ酶活性显著下降,YGW组明显优于ZGW组（P＜0.01）。比色法检测骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性含量结果:与SHAM组相比,OVX组骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性显著下降（P＜0.01）。与OVX组相比,ZGW组骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性略微上升（P＞0.05）、YGW、BJL组骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性显著上升（P＜0.01或P＜0.05）。与BJL组相比,ZGW、YGW组骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性下降（P＜0.01或P＜0.05）。与YGW组相比,ZGW组骨髓线粒体复合物Ⅱ酶活性无显著性差异（P＞0.05）。结论:1.PMOP模型大鼠骨结构改变,左、右归丸可以提高骨密度,调节骨脂平衡,防治PMOP,其中左归丸提高骨密度的能力优于右归丸。2.PMOP模型大鼠骨髓脂肪积累增加,脂质代谢紊乱。左、右归丸可以减少骨髓腔内骨髓堆积,其中右归丸提高PGC-1α蛋白表达优于左归丸。3.PMOP模型大鼠骨髓线粒体氧自由基增加,抗氧化能力减弱,发生氧化应激。左、右归丸促进抗氧化物酶生成,减少氧化损伤。其中右归丸提高线粒体功能优于左归丸。4.PMOP模型大鼠骨髓线粒体呼吸功能降低。左、右归丸能够提高线粒体呼吸功能,提高抗氧化能力。其中右归丸提高线粒体呼吸功能优于左归丸。5.左、右归丸均可调控PMOP模型大鼠PGC-1α表达、减少氧化损伤。其中左归丸偏于填精益髓、濡养骨骼;右归丸偏于补阳化浊、减少脂肪堆积。