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背景:骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一类以关节软骨退行性变为主要特征的骨关节疾病,好发于老年人,给患者造成躯体痛苦的同时,也为社会、家庭和患者个人增加了巨大的经济负担。目前OA的发病具体原因和机制尚不明确。许多研究认为,软骨细胞的代谢异常是OA发病中的重要原因,与软骨细胞介导的软骨各成分损伤有关。在众多分解代谢因素中,金属基质蛋白酶作为一类重要的蛋白家族,与细胞外基质成分中II型胶原蛋白和蛋白聚糖等成分的降解有着密切关系。基质金属蛋白酶-3（metalloproteinase-3,MMP-3）作为基质金属蛋白酶（metalloproteinases,MMPs）家族的一员,既往多报道与细胞外基质尤其是细胞外基质中蛋白聚糖的降解密切相关。Kruppel样因子15（Kruppel-like factor 15,KLF15）是含锌指结构转录因子家族（Kruppel-like factors,KLFs）的重要成员,具有多种生物学功能。然而,KLF15在软骨细胞中的生理作用以及与OA发病是否相关仍不清楚。本研究通过探求人软骨细胞中KLF15的表达及其与MMP-3合成的关系,探索其可能在软骨细胞生理、病理过程中的作用,为进一步阐明OA发病机制贡献了新的研究方向。具体研究内容分为以下三个部分:第一部分:人软骨细胞中KLF15的表达目的:明确软骨细胞中是否存在KLF15的表达及OA与健康人软骨细胞中KLF15的表达差异。材料与方法:1、细胞系:人软骨肉瘤细胞SW1353购买自中科院上海细胞库;OA及健康人软骨细胞为原代培养;人肾小球系膜细胞为实验室原存。2、方法:软骨细胞鉴定应用AEC II型胶原染色法及甲苯胺蓝染色法;各株细胞KLF15表达应用RT-PCR和western-blot方法;OA、健康人软骨细胞KLF15表达差异应用q RT-PCR、WB和细胞免疫荧光法。结果:1、软骨细胞形态学观察及II型胶原、多糖染色证明细胞培养成功。2、KLF15 m RNA及蛋白在各株软骨细胞中有表达。3、KLF15 m RNA及蛋白在OA软骨细胞中表达低于正常人软骨细胞。4、KLF15主要在软骨细胞核表达。结论:KLF15在软骨细胞中表达,在OA软骨细胞中表达及合成低于健康人软骨细胞,提示KLF15可能与OA发病有关。第二部分:KLF15下调TNF-α诱导的人软骨细胞MMP-3表达增加目的:明确SW1353软骨细胞中KLF15表达与MMP-3等细胞外基质分解蛋白表达和合成的关系。材料与方法:1、细胞系:人软骨肉瘤细胞SW1353购买自中科院上海细胞库。2、方法:评估TNF-α对KLF15表达和合成的影响应用q RT-PCR和WB法;评估过表达KLF15对细胞表达MMP-1、3、9、13和ADAMTS-4 m RNA表达的影响应用q RT-PCR和WB法;评估敲减KLF15对细胞表达MMP-1、3、9、13和ADAMTS-4 m RNA表达的影响应用q RT-PCR和WB法。结果:1.TNF-α对KLF15 m RNA表达和蛋白合成有抑制作用,且在一定浓度范围内呈剂量依赖关系。2.过表达KLF15降低软骨细胞中TNF-α诱导的MMP-3 m RNA的表达和蛋白合成。3.敲减KLF15增加软骨细胞中TNF-α诱导的MMP-3 m RNA的表达和蛋白合成。结论:TNF-α对软骨细胞表达KLF15有抑制作用;KLF15降低TNF-α诱导的MMP-3在软骨细胞的合成。第三部分:KLF15调节人软骨细胞MMP-3表达机制探讨目的:探讨SW1353软骨细胞中KLF15调节MMP-3表达的具体机制。材料与方法:1、细胞系:人软骨肉瘤细胞SW1353购买自中科院上海细胞库。2、方法:WB法检测TP53及磷酸化TP53水平对TNF-α诱导的KLF15蛋白合成的影响;应用q RT-PCR和WB法检测TP53磷酸化抑制剂pifithrin-α对TNF-α诱导的KLF15m RNA表达和合成的影响;将携带MMP-3启动子区质粒转染至SW1353细胞中,过表达KLF15慢病毒或空载慢病毒转染后,双荧光素酶报告实验（Dual luciferase reporter assay）检测KLF15对MMP-3启动子活性影响;软件预测KLF15与MMP-3启动子区可能结合位点,过表达KLF15慢病毒或空载慢病毒转染细胞,用或不用TNF-α处理后,染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）检测KLF15是否可与MMP-3启动子位点结合。结果:1.TNF-α诱导磷酸化TP53水平增加,p53抑制剂Pifithrin-α可显著逆转该过程。2.KLF15的过表达显著抑制MMP-3的启动子活性。3.KLF15能够与MMP-3的启动子区结合,且TNF-α处理减弱了KLF15向MMP-3启动子的募集。结论:TNF-α通过改变TP53磷酸化水平下调KLF15表达;KLF15可通过与MMP-3启动子区结合抑制MMP-3的转录。