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第一部分 H/R处理对HK-2细胞中23KD ALR的表达及铁死亡的影响
目的：体外观察在缺氧复氧（Hypoxia reoxygenation,H/R）对人肾小管上皮细胞（Human renal tubular epithelial cells,HK-2）的损伤中，23KD肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）及铁死亡相关蛋白的表达变化。
方法：采用三气培养箱（含有 94％N2、5％CO2、1％O2）和无糖无血清的培养基模拟HK-2细胞缺氧，结合正常培养箱复氧的方法，模拟HK-2细胞缺血再灌注（Ischemia reperfusion,I/R）损伤。Western Blot检测HK-2细胞中23KDALR及铁死亡相关蛋白xCT、TFR、ACSL4、GPX4表达变化。透射电镜观察HK-2细胞发生铁死亡后，线粒体形态学的变化。免疫荧光检测HK-2细胞中GPX4荧光光点表达情况。流式细胞学检测HK-2细胞在缺氧复氧下及加入铁死亡特异性抑制剂Fer-1后，对HK-2细胞内活性氧(reactive oxygen, ROS)水平的影响。
结果：Western Blot结果显示H/R处理HK-2后，细胞内23KDALR表达逐渐增高，后逐渐降低。在缺氧6h，复氧不同时间（3h、6h、12h、24h），铁死亡相关蛋白GPX4、xCT表达逐渐降低，TFR、ACSL4表达逐渐增高。免疫荧光提示在HK-2细胞中，GPX4荧光光点缺氧后表达减弱，且在复氧12h达到最低水平。HK-2细胞内ROS水平逐渐上升，外源性加入铁死亡特异性抑制剂Fer-1处理HK-2细胞后，细胞内ROS水平受到明显抑制。
结论：1. HK-2细胞在H/R 过程中，ALR 表达逐渐增高后降至正常，提示ALR与急性缺血再灌注肾损伤过程相关。
2. 肾小管上皮细胞在H/R下发生了铁死亡，且在复氧12h时间点达到高峰。
第二部分 构建23KD ALR 表达下调的HK-2细胞株
目的：将干扰人的23KD ALR表达的慢病毒转染HK-2细胞后，通过嘌呤霉素筛选出23 KDALR表达下调的HK-2细胞株。
方法：将特异性干扰人23KD ALR表达的慢病毒shRNA/ALR转染到HK-2细胞中。利用慢病毒载体含有嘌呤抗性特点，用嘌呤霉素对转染的HK-2细胞进行筛选，筛选出下调23KDALR的HK-2细胞株。Western Blot及Real-time PCR验证HK-2细胞中ALR转染的效果情况。通过CCK8检测HK-2细胞增值活性。
结果：Real-time PCR及WesternBlot结果均提示，与未处理组和shRNA/control对照组相比，shRNA/ALR组细胞内的ALR蛋白表达及mRNA水平明显减少（P＜0.05）。细胞增殖活性结果提示，干扰23KD ALR的表达后，对HK-2细胞的增殖无明显影响（P＞0.05）。
结论：成功构建并筛选出下调23 KD ALR表达的HK-2细胞株。
第三部分 下调23KD ALR表达后对H/R状态下处理的HK-2细胞铁死亡水平的影响及机制研究
目的：探讨下调23KD ALR表达后，对H/R状态下处理的HK-2细胞铁死亡水平的影响并探讨其作用机制。
方法：利用三气培养箱结合正常培养箱的方法，在体外对 HK-2 细胞进行H/R 处理，观察 HK-2 细胞铁死亡的发生。慢病毒 siRNA/ALR 及其对照siRNA/control转染HK-2细胞株后，Western Blot检测铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、TFR、ACSL4蛋白的表达情况；电镜检测HK-2细胞铁死亡发生的形态学变化；流式细胞学检测HK-2细胞内活性氧的水平变化；检测细胞内GPX4酶活性；免疫荧光和免疫共沉淀分别检测 ALR 与铁死亡关键调节蛋白 GPX4 的共定位及相互作用。
结果：Western Blot结果提示，与shRNA/control组相比，shRNA/ALR组发生铁死亡明显；电镜结果提示在H/R处理状态下，HK-2细胞线粒体体积缩小，基质颜色加深，线粒体嵴形态紊乱，在下调ALR的表达后，形态学变化更明显；流式细胞学结果提示干扰 ALR 表达后，HK-2 细胞在 H/R 下，细胞内 ROS 水平与shRNA/control组相比，明显增高；细胞内GPX4酶活性在H/R下，下调ALR表达后，与对照组相比，GPX4酶活性下降。免疫荧光提示GPX4主要在HK-2细胞包浆和细胞核皆有表达，但主要以包浆表达为主，ALR 主要在包浆表达；免疫共沉淀提示在HK-2细胞内，GPX4与ALR具有相互作用。
结论：23KD ALR参与了H/R诱导的HK-2细胞铁死亡的过程，下调23KD ALR表达后，加重了HK-2细胞铁死亡的水平发生，而这一作用可能与23KD ALR表达下调引起铁死亡关键通路胱氨酸/谷氨酸转运系统，进而影响GPX4酶活性，增加HK-2细胞内ROS水平。
目的：体外观察在缺氧复氧（Hypoxia reoxygenation,H/R）对人肾小管上皮细胞（Human renal tubular epithelial cells,HK-2）的损伤中，23KD肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）及铁死亡相关蛋白的表达变化。
方法：采用三气培养箱（含有 94％N2、5％CO2、1％O2）和无糖无血清的培养基模拟HK-2细胞缺氧，结合正常培养箱复氧的方法，模拟HK-2细胞缺血再灌注（Ischemia reperfusion,I/R）损伤。Western Blot检测HK-2细胞中23KDALR及铁死亡相关蛋白xCT、TFR、ACSL4、GPX4表达变化。透射电镜观察HK-2细胞发生铁死亡后，线粒体形态学的变化。免疫荧光检测HK-2细胞中GPX4荧光光点表达情况。流式细胞学检测HK-2细胞在缺氧复氧下及加入铁死亡特异性抑制剂Fer-1后，对HK-2细胞内活性氧(reactive oxygen, ROS)水平的影响。
结果：Western Blot结果显示H/R处理HK-2后，细胞内23KDALR表达逐渐增高，后逐渐降低。在缺氧6h，复氧不同时间（3h、6h、12h、24h），铁死亡相关蛋白GPX4、xCT表达逐渐降低，TFR、ACSL4表达逐渐增高。免疫荧光提示在HK-2细胞中，GPX4荧光光点缺氧后表达减弱，且在复氧12h达到最低水平。HK-2细胞内ROS水平逐渐上升，外源性加入铁死亡特异性抑制剂Fer-1处理HK-2细胞后，细胞内ROS水平受到明显抑制。
结论：1. HK-2细胞在H/R 过程中，ALR 表达逐渐增高后降至正常，提示ALR与急性缺血再灌注肾损伤过程相关。
2. 肾小管上皮细胞在H/R下发生了铁死亡，且在复氧12h时间点达到高峰。
第二部分 构建23KD ALR 表达下调的HK-2细胞株
目的：将干扰人的23KD ALR表达的慢病毒转染HK-2细胞后，通过嘌呤霉素筛选出23 KDALR表达下调的HK-2细胞株。
方法：将特异性干扰人23KD ALR表达的慢病毒shRNA/ALR转染到HK-2细胞中。利用慢病毒载体含有嘌呤抗性特点，用嘌呤霉素对转染的HK-2细胞进行筛选，筛选出下调23KDALR的HK-2细胞株。Western Blot及Real-time PCR验证HK-2细胞中ALR转染的效果情况。通过CCK8检测HK-2细胞增值活性。
结果：Real-time PCR及WesternBlot结果均提示，与未处理组和shRNA/control对照组相比，shRNA/ALR组细胞内的ALR蛋白表达及mRNA水平明显减少（P＜0.05）。细胞增殖活性结果提示，干扰23KD ALR的表达后，对HK-2细胞的增殖无明显影响（P＞0.05）。
结论：成功构建并筛选出下调23 KD ALR表达的HK-2细胞株。
第三部分 下调23KD ALR表达后对H/R状态下处理的HK-2细胞铁死亡水平的影响及机制研究
目的：探讨下调23KD ALR表达后，对H/R状态下处理的HK-2细胞铁死亡水平的影响并探讨其作用机制。
方法：利用三气培养箱结合正常培养箱的方法，在体外对 HK-2 细胞进行H/R 处理，观察 HK-2 细胞铁死亡的发生。慢病毒 siRNA/ALR 及其对照siRNA/control转染HK-2细胞株后，Western Blot检测铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、TFR、ACSL4蛋白的表达情况；电镜检测HK-2细胞铁死亡发生的形态学变化；流式细胞学检测HK-2细胞内活性氧的水平变化；检测细胞内GPX4酶活性；免疫荧光和免疫共沉淀分别检测 ALR 与铁死亡关键调节蛋白 GPX4 的共定位及相互作用。
结果：Western Blot结果提示，与shRNA/control组相比，shRNA/ALR组发生铁死亡明显；电镜结果提示在H/R处理状态下，HK-2细胞线粒体体积缩小，基质颜色加深，线粒体嵴形态紊乱，在下调ALR的表达后，形态学变化更明显；流式细胞学结果提示干扰 ALR 表达后，HK-2 细胞在 H/R 下，细胞内 ROS 水平与shRNA/control组相比，明显增高；细胞内GPX4酶活性在H/R下，下调ALR表达后，与对照组相比，GPX4酶活性下降。免疫荧光提示GPX4主要在HK-2细胞包浆和细胞核皆有表达，但主要以包浆表达为主，ALR 主要在包浆表达；免疫共沉淀提示在HK-2细胞内，GPX4与ALR具有相互作用。
结论：23KD ALR参与了H/R诱导的HK-2细胞铁死亡的过程，下调23KD ALR表达后，加重了HK-2细胞铁死亡的水平发生，而这一作用可能与23KD ALR表达下调引起铁死亡关键通路胱氨酸/谷氨酸转运系统，进而影响GPX4酶活性，增加HK-2细胞内ROS水平。