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原癌基因HER-2／neu在人类的多种肿瘤细胞中异常扩增或过表达，它参与了肿瘤的发生、发展及恶性化转移，并且HER-2／neu蛋白的高水平表达已被作为判断肿瘤患者预后不良的一个独立指标。以HER-2／neu蛋白为靶分子的肿瘤疫苗研究已受到广泛关注。HER-2／neu配体结合区(RLD)是位于HER-2／neu蛋白胞外的结构域，我们将HER-2／neu RLD蛋白表达、纯化及甘露糖化修饰，从而为新型甘露糖化肿瘤疫苗的研制奠定了基础。 本课题研究的主要工作及结果有以下4个方面： (一)HER-2／neu胞外配体结合区蛋白的生物信息学分析 利用Blast程序、BIMAS、SYFPEITHI和Goldkey等计算机软件对HER-2／neu RLD蛋白的抗原特异性、所包含的CTL表位以及蛋白的亲疏水性、等电点等进行了生物信息学分析。 (二)HER-2／neu RLD2蛋白的可溶性表达及纯化 用PCR技术扩增HER-2／neu第二配体结合区(RLD2)cDNA，并将扩增的基因片段克隆于硫氧还蛋白(TrXA)原核表达载体中，获得TrxA-RLD2融合蛋白的可溶性表达。通过插入偶联翻译序列，实现TrxA与RLD2蛋白在大肠杆菌中的共表达，并且目的蛋白以可溶性形式存在。表达产物经免疫印记分析可被抗HER-2／neu特异性抗体识别。经离子交换层析和钴亲和层析纯化，RLD2蛋白的纯度达90％。用质谱法分析RLD2蛋白的分子量，与预期值相符。HER-2／neu RLD2蛋白的高效可溶性表达为蛋白质的甘露糖化修饰打下了基础。 (三)HER-2／neu RLD蛋白的原核表达、纯化及复性研究 采用PCR技术将HER-2／neu的2段RLD基因分别扩增，并利用基因片段末端的共同酶切位点，通过基因重组方法将2段基因直接连接，从而剔除了在2个RLD区之间的富含半胱氨酸区基因。将连接产物插入到原核表达载体中，在大肠杆菌中实现了融合蛋白的高效表达。经Western-blotting检测，表达产物可被HER-2／neu特异性抗体识别，表明融合蛋白的抗原特异性未发生改变。经SDS-PAGE分析，表达产物以包涵体形式存在，通过变性、纯化和复性等处理，获得了可供肿瘤疫苗研究用的含2个RLD的融合蛋白。中文摘要(四)HER一2/neu RLDZ蛋白的甘露糖化修饰 纯化后的RLDZ蛋白在体外用化学方法进行了甘露糖化修饰。通过质谱法对糖基化产物进行分析，新合成的RLDZ拟糖蛋白在质谱图上呈现相应于甘露糖修饰后蛋白质分子量的预期峰形。经间苯二酚一硫酸法进一步鉴定，结合于RLDZ蛋白上的化学基团确为糖分子。HER一2/neu RLDZ蛋白的甘露糖化修饰，为开展甘露糖化受体介导的抗原提呈及肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。