脂肪酶是一种可以催化水解和合成反应的多功能性酶,广泛应用于各大工业。黑曲霉能够将大量蛋白质分泌到细胞外,是脂肪酶的重要生产者。先前研究发现,来自黑曲霉GZUF36菌株sn-1,3选择性胞外脂肪酶（EXANL1）在较宽pH范围内酶活保持稳定,对底物具有较高sn-1,3选择性,有良好应用价值。但黑曲霉GZUF36菌株的产酶状况不稳定,培养周期长,酶学性质还需进一步研究,从结构上对底物的选择性机制研究尚不清楚。为解决上述问题,首先,本课题以黑曲霉GZUF36菌株sn-1,3选择性胞外脂肪酶（EXANL1）为研究对象,采用融合表达的方式,实现脂肪酶EXANL1在大肠杆菌的异源表达。其次,重组表达的融合蛋白分离纯化后详细研究了脂肪酶EXANL1的酶学性质。最后,基于圆二色谱（CD）对EXANL1进行了结构表征,通过分子对接研究了EXANL1的底物选择性,使用预测结晶可能性的软件预测了EXANL1的结晶可能性大小。上述研究为EXANL1进一步工业应用的方向及三维结构研究提供了理论依据和基础。主要研究内容和结果如下:（1）脂肪酶EXANL1在大肠杆菌中的克隆表达,纯化及包涵体复性根据实验室前期报道的黑曲霉脂肪酶基因ANL（NCBI登录号:MK592411.1）,成功实现编码成熟肽基因在大肠杆菌BL21中（DE3）低温下诱导的活性表达。探讨了不同条件对重组大肠杆菌表达的脂肪酶表达量的影响。结果表明,当诱导剂浓度（IPTG）为0.05 mM,OD600为0.6,诱导后培养时间为20h,诱导后培养温度为16℃时,脂肪酶的比酶活最高达到3.74 U/mg,比初始培养条件提高了2.7倍。发酵上清液经过谷胱甘肽树脂和阴离子交换层析后获得了电泳纯的脂肪酶EXANL1。使用透析复性的方法进行包涵体复性,得到了具有活性的蛋白质,与未复性的包涵体溶解液相比,复性后的EXANL1酶活为8.66±0.30U/mL。（2）EXANL1的酶学性质研究酶学性质研究显示,EXANL1最适pH为4,EXANL1在pH 6-9的缓冲液中孵育48 h,相对酶活损失低于45%,说明EXANL1在酸性条件下有最适pH但在碱性条件下稳定。EXANL1的最适温度为40℃,在55℃以下的稳定性较高,说明EXANL1是一个中温脂肪酶。在40%（v:v）的有机溶剂中,EXANL1同时对极性有机溶剂丙三醇和二甲基亚砜,非极性有机溶剂正己烷和甲苯表现出强耐受性,相对酶活高于75%。EXANL1在所测的低浓度（终浓度为0.01%）表面活性剂中,相对酶活均在85%以上。EXANL1在5%（m/v）的聚乙二醇2000中,酶活依然保持稳定,而同一浓度下的其他表面活性剂均抑制EXANL1的活性。在5 mM的Cu2+中EXANL1出现超酶活现象而1mM的Fe3+已抑制酶活。底物特异性试验表明EXANL1最适底物为对硝基棕榈酸酯,却几乎不水解短链脂肪酸（C 2-C 8）。（3）底物特异性分析圆二色谱研究了不同温度下EXANL1二级结构的变化。当温度高于55℃时,α螺旋的比例显著下降。分子对接显示,脂肪酶EXANL1和其他sn-1,3选择性脂肪酶的结合口袋类似,形状如花生壳,具有两个口袋。与无显著区域选择性的其他脂肪酶的3D结构的催化口袋相比,推测口袋大小和形状的差异可能影响脂肪酶的区域选择性及对不同碳链长度的偏好性。相对于底物sn-2位置上的酯键,EXANL1催化三联体ser 173上的羟基氧与底物sn-1及sn-3上的羰基碳的距离更近,分子对接的这些结果可初步解释EXANL1是sn-1,3选择性脂肪酶。分子对接研究了EXANL1对不同链长的对硝基苯酚酯的亲和性,表明尽管脂肪酶与对硝基己酸酯的结合能最低,但是对硝基己酸酯并没有与EXANL1的催化三联体形成分子间氢键;分子对接亦显示EXANL1对对硝基棕榈酸酯的特异性最高,这与实验得到的结果吻合。结晶可能性预测软件预测EXANL1具有结晶的可能,可尝试进行进一步的结晶实验。上述研究为EXANL1的进一步工业应用的方向,底物特异性及晶体学结构研究提供了理论依据和基础。