目的近年来星形胶质细胞在中枢神经系统中的作用正日益受到重视,而且星形胶质细胞与癫痫的发生与发展有着密切的关系。本课题旨在通过研究苯妥英钠(Phenytoin Sodium)慢性作用及停药后对人星状胶质细胞(human astrocytes, HA)氨基酸递质的释放以及与之密切相关的多种代谢酶及转运体mRNA表达的影响,探讨星形胶质细胞在苯妥英钠抗癫痫机制以及停药反跳机制中所起的作用,以期为更好地预防和控制苯妥英钠停药反跳以及新型抗癫痫药物的研究与开发提供实验依据。方法本实验用人星状胶质细胞建立苯妥英钠慢性作用的星形胶质细胞模型。从氨基酸递质释放、mRNA表达和蛋白表达三个水平以及停药后0小时、12小时、24小时、36小时、48小时和60小时六个时间点来检测苯妥英钠慢性作用后快速停药对HA细胞的影响。本实验采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)检测HA细胞天门冬氨酸(Aspartate, Asp)、谷氨酸(Glutamatc, Glu)、天门冬酰胺(Asparatmine, Asn)、谷氨酰胺(Glutamine, Gln)、甘氨酸(Glycine, Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的释放量；采用实时荧光定量PCR方法检测与这些氨基酸代谢相关的酶及其转运体mRNA表达水平的变化,包括谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸／谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)、谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、谷氨酸转运体1(GLT-1／EAAT-2)、谷氨酸／天门冬氨酸转运体(GLAST)、GABA转运体3(GAT--3)；用western blot方法检测谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GLUL)蛋白表达水平的变化。结果1、苯妥英钠慢性作用可促进HA细胞Gly和GABA的释放,抑制Glu的释放,而对Gln,Asn和Asp的释放的影响没有统计学意义。停药后Glu、Gly和GABA的释放呈反跳样变化。1)对照组、苯妥英钠组和停药组的Asp释放量分别为70.381±1.282(nM／106cells)、70.510±0.752(nM／106 cells)和70.432±2.522(nM／106 cells),经重复测量方差分析,结果显示组间差异没有显著性(F=0.196,P=0.827),表明苯妥英钠慢性作用及停药与对照组相比,氨基酸含量差异没有统计学意义,不同时间点各组之间差异也没有显著性(F=0.299,P=0.684),不同处理方法同时间之间没有交互作用(F=2.241,P=0.156),提示不同处理方法随时间的增加,氨基酸含量变化趋势相同。提示停药后Asp的释放量的变化可能与停药反跳无关。2)经重复测量方差分析,结果显示组间差异有显著性意义(F=203001.496,P=0.000)。不同时间点各组之间差异也有显著性(F=830.839,P=0.000),不同处理方法同时间之间有交互作用(F=872.735,P=0.000),提示不同处理方法随时间的增加,氨基酸含量变化趋势不相同。进一步分析单独效应,苯妥英钠给药组的平均Glu释放量为24.131±0.300(nM／106 cells),比对照组83.026±0.807(nM／106 cells)降低有显著性差异(P=0.000),停药组的Glu释放量38.037±14.512(nM／106 cells)与对照组相比其差别也有统计学意义(P=0.000)；而与苯妥英钠组相比,停药组的Glu释放量又有了有显著性差异的升高(P=0.000),表明,苯妥英钠可减少HA细胞培养上清的Glu的释放,停药后使Glu的含量增加。在各个停药时间点对照组、苯妥英钠组和停药组之间Glu释放量的进行比较。停药后,各个时间点各组之间均有有统计学意义的差别。在停药的过程中,停药组Glu的释放表现为先升后降,变化呈倒“V”字型。停药36h时Glu的释放水平最高,为66.763±1.336(nM／106 cells),但仍然低于对照组水平,然后逐渐下降接近至给药组水平。提示停药后Glu释放量的变化可能与停药反跳有关。3)对照组、苯妥英钠组及停药组的Asn释放量分别为24.177±0.242(nM／106cells),24.204±0.238(nM／106 cells)和24.278±0.517(nM／106 cells),经重复测量方差分析,结果显示组间差异没有显著性(F=1.823,P=0.241)。表明苯妥英钠慢性作用及停药与对照组相比,氨基酸含量差异没有统计学意义。不同时间点各组之间差异也没有显著性意义(F=0.450,P=0.602),不同组别与时间之间没有交互作用(F=2.386,P=0.134),提示不同处理方法随时间的增加,氨基酸含量变化趋势相同。提示停药后Asn的释放量的变化可能与停药反跳无关。4)对照组、苯妥英钠组及停药组的Gln释放量分别为64.151±0.433(nM／106cells),64.199±0.270(nM／106 cells)和64.454±0.715(nM／106 cells),经重复测量方差分析,结果显示组间差异没有显著性(F=1.877,P=0.233)。表明苯妥英钠慢性作用及停药与对照组相比,氨基酸含量差异没有统计学意义不同时间点各组之间差异也没有显著性(F=0.515,P=0.520),不同组别与时间之间没有交互作用(F=2.550,P=0.147),提示不同处理方法随时间的增加,氨基酸含量变化趋势相同。提示停药后Gln的释放量的变化可能与停药反跳无关。5)经重复测量方差分析,结果显示组间差异有显著性意义(F=56,638.084,P=0.000),不同时间点各组之间差异也有显著性(F=337.026,P=0.000),处理方法同时间之间有交互作用(F=340.405,P=0.000),提示不同处理方法随时间的增加,氨基酸含量变化趋势不相同。进一步分析单独效应,苯妥英钠给药组的平均Gly释放量为423.550±1.373(nM／106 cells),比对照组206.086±0.734(nM／106 cells)升高有显著性差异(P=0.000),停药组的Gly释放量243.519±86.781(nM／106 cells)与对照组相比其差别也有显著性升高(P=0.000)；而与苯妥英钠组相比,停药组的Gly释放量又有了显著性差异的降低(P=0.000),表明,苯妥英钠可促进HA细胞Gly的释放,停药后Gly释放减少。通过连续测定苯妥英钠慢性作用后停药0h、12h、24h、36h、48h和60h HA细胞的Gly释放水平,分析停药引起的Gly释放量动态变化情况。停药后,各个时间点均有有统计学意义的差别。停药组的Gly释放量变化呈“W”字型的波动表现,即先由0h时持续下降至24h时到达最低点,此时低于对照组水平,差异有显著性意义(P=0.000),然后再上升至36h时,又在48h时缓慢降低至对照组水平下,最后逐渐上升至60h时超过对照组水平,总体水平均低于给药组GLY释放量。提示停药后Gly释放量的变化可能与停药反跳有关。6)经重复测量方差分析,结果显示组间差异有显著性意义(F=366812.466,P=0.000),不同时间点各组之间差异也有显著性(F=1059.855,P=0.000),处理方法同时间之间有交互作用(F=1137.309,P=01.000),提示不同处理组随时间的增加,氨基酸含量变化趋势不相同。进一步分析单独效应,苯妥英钠给药组的平均GABA释放量为215.365±1.163(nM／106 cells),比对照组107.686±1.378(nM／106 cells)升高有显著性差异(P=0.000),停药组的GABA释放量112.342±52.474(nM／106 cells)与对照组相比其差别也有显著性升高(P=0.000)；而与苯妥英钠组相比,停药组的GABA释放量又有了显著性差异的降低(P=0.000),表明,苯妥英钠可促进HA细胞GABA的释放,停药后GABA释放减少。通过连续测定苯妥英钠慢性作用后停药Oh、12h、24h、36h、48h和60h HA细胞的GABA释放水平,分析停药引起的GABA释放量动态变化情况。在各个停药时间点对照组、苯妥英钠组和停药组之间GABA释放量的两两比较,在各个时间点各组之间GABA释放量都没有显著性差异。在停药24h之后停药组的GABA释放量已经低于对照组；在停药36h时停药组GABA释放量有所回升,但仍然低于对照组,在接下来的实验过程中,对照组的GABA释放量均在对照组水平下波动,提示苯妥英钠停药反跳可能跟GABA的含量变化有关。停药组的GABA释放量变化呈下降的趋势,总体水平均低于给药组GABA释放量。提示停药后Gly释放量的波动变化可能与停药反跳有关。2、实时荧光定量PCR检测结果显示,苯妥英钠慢性作用使谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、谷氨酸转运体1(GLT-1／EAAT-2)、谷氨酸／天门冬氨酸转运体(GLAST)mRNA相对表达量升高,使甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、GABA转运体3(GAT--3)的mRNA相对表达量降低,停药后这些基因的mRNA相对表达量呈反跳样变化。谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸／谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相对表达量在给药和给药停药后没有发生显著性变化。苯妥英钠慢性给药后及给药停药后,对HA细胞的GLUL蛋白的变化没有可检测到的影响,这与之前的氨基酸检测、氨基酸代谢酶及相关转运体的检测结果相吻合。结论采用HPLC检测HA细胞在苯妥英钠慢性作用及停药后Asp、Glu、Asn、Gln、Gly和GABA释放量的变化。结果显示,苯妥英钠慢性作用可促进HA细胞Gly和GABA的释放,抑制Glu的释放,而对Asn、Asp和Gln的释放的影响没有显著性意义。提示苯妥英钠慢性作用后停药可引起HA细胞Glu、Asp和GABA的释放呈反跳样变化,对Asn、Asp和Gln的释放的影响也没有显著性意义。实时荧光定量PCR检测结果显示,苯妥英钠慢性作用使与之相关的一些代谢酶及转运体如谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、谷氨酸转运体1(GLT-1／EAAT-2)、谷氨酸／天门冬氨酸转运体(GLAST)mRNA相对表达量升高,甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、GABA转运体3(GAT--3)的mRNA相对表达量降低,停药后这些基因的mRNA相对表达量呈反跳样变化。提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生可能有关。谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸／谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相对表达量在给药和给药停药后没有发生显著性变化。提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生可能没有关系。Western blot结果显示,苯妥英钠慢性作用对HA细胞的GLUL蛋白表达没有可检测到的变化。给药后GLUL蛋白表达与给药组、对照组,也没有可检测到的差异,说明GLUL蛋白可能与苯妥英钠停药反跳发生的机制无关。可见,苯妥英钠慢性作用后停药可引起HA细胞Glu、Asp和GABA的释放呈反跳样变化,与之相关的一些代谢酶及转运体mRNA表达水平也出现相应的反跳样变化,提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生有关。由此推测星形胶质细胞的氨基酸释放能力在苯妥英钠抗癫痫机制中具有重要作用,与苯妥英钠停药反跳的发生密切相关。详细机制尚需进一步研究。创新之处：1、建立了人神经胶质细胞苯妥英钠慢性作用模型并予以应用。2、从氨基酸递质含量的变化角度来阐述所研究的问题,并从氨基酸含量水平、氨基酸代谢酶及相关转运体mRNA水平和氨基酸代谢酶及相关转运体蛋白水平三个层次来研究相关的机制。3、为临床药物的实际应用提供了参考信息,为研究苯妥英钠的抗癫痫作用机制奠定了基础。