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节肢动物的肠道中存在大量微生物,主要包括细菌,真菌,古菌,原生动物和病毒。其中肠道微生物在宿主的营养提供、消化吸收、生长发育和抵抗病原入侵等方面发挥着重要作用。蜘蛛属节肢动物门、蛛形纲、蜘蛛目,种类繁多,分布广泛,是农作物害虫的重要天敌。目前对蜘蛛体内微生物的研究主要集中于内共生菌及其对宿主生殖发育的影响,对蜘蛛肠道微生物的研究较少。为了解蜘蛛肠道微生物的组成,并在此基础上探索其功能,本文主要利用高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)检测了卡式毛园珠(Eriovixia cavaleriei)、角类肥蛛(Larinioides cornutus)和拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)三种蜘蛛的肠道及生殖腺的细菌和真菌类群的多样性,分析比较了同种蜘蛛不同器官之间、雌雄蛛之间的微生物菌群的组成差异,预测了肠道和生殖腺微生物的功能。并探索了不同捕食方式的蜘蛛的微生物组成差异,以及利用传统细菌培养方法分离培养了两种不同捕食方式蜘蛛的肠道细菌。本研究为进一步研究蜘蛛体内细菌和真菌菌群与宿主的相互关系、进一步探讨肠道细菌的功能、更加完善蜘蛛体内微生物的研究奠定了重要的理论基础。主要实验结果如下:1.三种蜘蛛的中后肠、卵巢和精巢的解剖及形态结构观察解剖观察发现,试验所用三种蜘蛛的肠道结构相似:中后肠细长,末端膨大形成椭圆形的粪袋,粪袋上连接一对马氏管,肠壁上有细小分支。卡氏毛园蛛和角类肥蛛的卵巢和精巢细长,而拟环纹豹蛛的卵巢和精巢形态和大小与卡氏毛园蛛、角类肥蛛有明显差异。2.三种蜘蛛雌雄肠道和生殖腺细菌菌群的多样性和差异分析通过Illumina的Hiseq平台对卡式毛园蛛、角类肥蛛和拟环纹豹蛛三种蜘蛛雌雄蛛的肠道和生殖腺的细菌16S r RNA的高可变V3-V4区进行检测,检测三种蜘蛛体内的细菌多样性。结果表明,蜘蛛体内存在大量的细菌类群,在三种蜘蛛的肠道中,变形菌门Proteobacteria是卡氏毛园蛛、角类肥蛛和拟环纹豹蛛肠道中的优势菌门。同种蜘蛛的雌雄肠道之间的菌群结构在门水平上无显著差异(P>0.05),变形菌门在卡氏毛园蛛肠道中的相对丰度显著高于在角类肥蛛和拟环纹豹蛛肠道中的相对丰度(P<0.05)。在属分类学水平上,Wolbachia在卡氏毛园蛛的肠道具有较高的丰度,在角类肥蛛的肠道中,螺原体属Spiroplasma这一内共生菌的相对丰度较高,除Lachnospiraceae＿NK4A136＿group外,相对丰度>1%的肠道细菌属的相对丰度在每种蜘蛛的雌雄肠道之间无显著性差异(P>0.05)。Beta多样性分析也表明:每种蜘蛛的雌雄肠道间的细菌群落结构没有差异,但三种蜘蛛的肠道之间的细菌群落结构有一定差异。在三种蜘蛛的雌雄生殖腺中,变形菌门在卡氏毛园蛛卵巢中的相对丰度(93.08%)显著高于在卡氏毛园蛛精巢中的相对丰度(65.19%)(P<0.05),其他优势菌门在卡氏毛园蛛精巢中的相对丰度显著高于在卡氏毛园蛛卵巢中的相对丰度(P<0.05);除软壁菌门外,其他优势菌门的相对丰度在角类肥蛛的雌雄肠道间无显著性差异(P>0.05);在拟环纹豹蛛的生殖腺中,变形菌门、拟杆菌门和放线菌门的相对丰度在卵巢和精巢间有显著性差异(P<0.05)。在属分类学水平上,Wolbachia在卡氏毛园蛛卵巢中的相对丰度(91.94%)显著高于在卡氏毛园蛛精巢中的相对丰度(57.31%)(P<0.05),在相对丰度前30的细菌属中,大部分菌属的相对丰度在每种蜘蛛的卵巢和精巢间都存在显著性差异(P<0.05)。Beta多样性分析结果表明:卡氏毛园蛛、角类肥蛛的卵巢与精巢的细菌群落结构存在差异,拟环纹豹蛛的卵巢和精巢中的细菌群落结构比较相似,三种蜘蛛的生殖腺之间的细菌群落结构存在一定差异。通过比较分析同种蜘蛛同一性别的肠道和生殖腺中细菌的相对丰度,发现在相对丰度前30的细菌属中,每种蜘蛛的雌蛛肠道与卵巢之间几乎不存在相对丰度有差异的菌,但有一部分菌在每种蜘蛛的雄蛛肠道和精巢之间显示出了丰度差异。肠道和生殖腺的细菌功能预测发现蜘蛛体内细菌与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅酶和维生素代谢、能量代谢、核苷酸代谢、翻译等相关。3.三种蜘蛛雌雄肠道和生殖腺真菌群的多样性和差异分析三种蜘蛛的雌雄肠道和生殖腺真菌共检测到了252个OTU。三种蜘蛛的肠道中,在门分类学水平上,子囊菌门为最优势的菌门,其中子囊菌门在卡氏毛园蛛雄蛛肠道中的相对丰度高达92.97%,子囊菌门和担子菌门的相对丰度在卡氏毛园蛛雌雄肠道间有显著性差异(P<0.05),子囊菌门和担子菌门的相对丰度在角类肥蛛、拟环纹豹蛛雌雄肠道间无显著性差异(P>0.05)。在属分类学水平上,马拉色氏霉菌属Malassezia是三种蜘蛛肠道中的主要优势菌属,除假丝酵母菌Candida外,其他菌属的相对丰度在卡氏毛园蛛、角类肥蛛的雌雄肠道间无显著性差异(P>0.05);拟环纹豹蛛的雌雄肠道的真菌物种多样性较高,除帚枝霉属Sarocladium外,其他菌属的相对丰度在拟环纹豹蛛的雌雄肠道间无显著性差异(P>0.05)。Beta多样性分析显示,卡氏毛园蛛、拟环纹豹蛛的雌雄肠道间的真菌组成结构相似,角类肥蛛的雌雄肠道间的真菌组成结构存在一定差异,三种蜘蛛的肠道之间的真菌结构有所差异。在三种蜘蛛的生殖腺中,注释到了6个门,子囊菌门是三种蜘蛛卵巢、精巢中最优势的菌门,子囊菌门在卡氏毛园蛛精巢中的相对丰度显著高于在卵巢中的相对丰度(P<0.05),子囊菌门和担子菌门的相对丰度在角类肥蛛和拟环纹豹蛛的卵巢、精巢间无显著性差异(P>0.05)。在属水平上,有部分真菌属的相对丰度在卡氏毛园蛛、角类肥蛛、拟环纹豹蛛的卵巢和精巢间有显著性差异(P<0.05);拟环纹豹蛛的卵巢和精巢中的一部分真菌属有着较高的丰度。Beta多样性分析结果显示:每种蜘蛛的卵巢和精巢之间的真菌组成结构相似,且三种蜘蛛的生殖腺间的真菌结构存在一定的差异。通过比较分析同种蜘蛛同一性别的肠道和生殖腺中真菌的相对丰度,发现只有极少的菌在每种蜘蛛的肠道和生殖腺之间存在丰度差异。4.蜘蛛肠道中可培养细菌的分离与鉴定用LB、NA培养基对卡氏毛园蛛肠道细菌进行分离培养,筛选出的细菌鉴定属于放线菌门、变形菌门和厚壁菌门,鉴定到属有丙酸杆菌属Propionibacterium、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、芽孢杆菌属Bacillus、类芽孢杆菌属Paenibacillus、Fictibacillus phosphorivorans。用1/5LB培养基对拟环纹豹蛛排泄物进行分离培养,鉴定到属的菌株有Corticibacterium populi、不动杆菌属Acinetobacter、粪肠球菌Enterococcus faecalis、假单胞菌属Pseudomonas、葡萄球菌属Staphylococcus、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium、微小杆菌属Exiguobacterium和丛毛单胞菌属Comamonas,对实验的拟环纹豹蛛用人工饲料培养2个月后取排泄物进行培养,分离的菌株鉴定的有肠杆菌属Enterobacter、不动杆菌属Acinetobacter、假单胞菌属Pseudomonas、葡萄球菌属Staphylococcus、金黄杆菌属Chryseobacterium。人工饲料养殖前后的拟环纹豹蛛的肠道细菌主要属于变形菌门和厚壁菌门,人工饲料养殖后,排泄物颜色变浅且排泄物可培养细菌减少。