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丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草属多年生药用植物,以干燥根及根茎入药。丹参的主要活性成分可以分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类两大类。随着丹参基因组、转录组、代谢组以及蛋白组数据的逐渐丰富,对丹参的研究越来越深入,而提高丹参中活性成分的含量和丹参根系的产量,是丹参育种工作的终极目标,也是提高丹参药材质量的关键环节。SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-Like）基因家族编码植物中特有的一类转录因子,在植物的营养相变、信号转导及胁迫应答等过程中发挥重要的作用。SPL基因家族已在拟南芥、水稻、玉米、桦树、番茄等多种植物中被鉴定。目前,对丹参中SPL基因的研究非常少,关于丹参中15个SPL基因的具体功能研究未见报道。基于此,本研究利用丹参基因组数据库对丹参SmSPL6基因和启动子区进行克隆,并构建至不同载体以研究SmSPL6基因的表达模式以及其调控丹参酚酸类物质生物合成和根系发育的分子机制。该研究为提高丹酚酸类物质的含量和提升丹参根系品质提供了参考。根据进化树分析结果,我们发现拟南芥AtSPL9与丹参SmSPL6聚类在同一亚家族,而大量的文献报道表明拟南芥AtSPL9即可以参与植物的次生代谢过程,又会影响植物的侧根生长。基于此,本研究选择丹参SmSPL6作为研究对象,以期探究SmSPL6是否也参与调控丹参的次生代谢,并且影响丹参的侧根发育。主要研究内容及结果如下:1.丹参SmSPL6包含一个1083 bp的开放阅读框,编码360个氨基酸,含有SBP保守结构域,同时其氨基酸序列的三级结构符合SPL转录因子的典型特征。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,SmSPL6在丹参的根、茎、花、以及不同年龄的叶中等不同组织部位都表达,其中在上层叶中表达量最高。外源喷施MeJA、IAA、GA和ABA处理丹参幼苗,qRT-PCR检测处理不同时间后的丹参中SmSPL6的表达水平,结果表明SmSPL6响应多种外源激素的处理,其中MeJA和IAA可以显著抑制该基因的表达。2.克隆了SmSPL6基因5’端862 bp的启动子区,在线网站PlantCARE分析SmSPL6的启动子,分析发现其上有响应赤霉素、生长素、脱落酸等植物激素的顺式作用元件。将SmSPL6的启动子构建至含有GUS蛋白的pCAMBIA1391Z载体上获得proSmSPL6::GUS表达载体,利用农杆菌GV3101介导的拟南芥花序浸染法获得转基因拟南芥植株,潮霉素（HygB）筛选阳性转基因拟南芥植株至T2代,对拟南芥的GUS染色结果表明,在proSmSPL6::GUS转基因拟南芥的不同时期和不同组织部位均可检测到较强的GUS信号。3.通过Gateway技术将SmSPL6分别构建至含有绿色荧光蛋白的亚细胞定位载体pEarlygate103以及酵母诱饵表达载体pGBKT7-GW,利用GV3101介导的浸染洋葱表皮细胞的方法进行SmSPL6的亚细胞定位实验,结果表明SmSPL6定位在细胞核中,酵母AH109菌株介导的转录自激活实验表明SmSPL6具有转录自激活活性。4.构建了丹参SmSPL6的过表达载体,利用EHA105介导的叶盘转化法获得转基因丹参植株,测定了 SmSPL6过表达植株OE5、OE6和OE8中总酚酸、总黄酮、总花青素的含量。结果表明三个过表达株系中只有OE5的总酚酸含量相较于CK显著增加,OE5、OE6及OE8中总酚酸含量分别是对照CK的1.36倍、1.18倍和1.26;同时OE5和OE6中总黄酮含量显著增加,分别为CK的2.11倍、1.42倍,OE8中总黄酮含量为CK的1.12倍。而SmSPL6过表达株系中总花青素含量降低,其中OE5和OE8植株中总花青素含量显著降低,分别为CK的76.9%和86.2%,OE6中总花青素含量为CK的93.4%。说明SmSPL6对丹参总酚酸和总黄酮的积累有促进作用,而抑制总花青素的积累。5.利用高效液相色谱测定了SmSPL6过表达株系中酚酸类有效成分的积累情况。结果表明SmSPL6基因过表达后,转基因丹参全株株系以及根中的迷迭香酸（RA）和丹酚酸B（SalB）的含量均显著增加,相比于CK,过表达株系OE5中酚酸类成分含量变化最大,OE5全株中RA含量为CK的1.39倍,SalB含量为CK的3.69倍;根中RA和SalB的含量变化更大,分别是CK的2.36倍和8.19倍,表明SmSPL6正调控丹酚酸类物质的生物合成。6.SmSPL6过表达植株根系的形态结构发生了明显变化,包括根长、侧根数量、鲜重等指标。分析结果表明,SmSPL6过表达转基因丹参的不定根长度显著增长,OE5、OE6和OE8的根长分别是野生型根长的1.88倍、2.01倍和2.36倍,但丹参侧根数目减少,根系鲜重也显著降低,转基因株系OE5、OE6和OE8根的鲜重分别为野生型根鲜重的80.75%、77.52%和49.74%。测定了对照CK和转基因株系OE5、OE6和OE8根中的内源生长素含量,结果表明OE5、OE6株系中生长素含量均显著降低,分别为CK的84.9%和79.3%,而过表达株系OE8中生长素含量与CK相比无显著差异,但也表现出下降趋势,为CK的95.9%。7.对长势良好的丹参SmSPL6过表达植株OE5和对照CK株系的全株进行转录组测序以及差异表达基因分析。在FDR=0.01,FC=2的条件下筛选差异表达基因（DEGs）,OE5中筛选到DEGs 815个,其中上调的基因有188个,上调倍数最高的是SmSPL6,相比于CK上调了约28倍,而其余187个显著上调的基因相比于CK上调倍数均小于8倍;下调的基因有627个,有18个基因变化最显著,大约下调为CK的6%。这些差异表达基因中与植物代谢相关的基因最多,共有231个,占了注释基因的63.99%。分析了 OE5株系转录组数据中酚酸类物质合成途径、花青素合成通路以及生长素信号通路中的差异表达基因,为深入研究SmSPL6调控丹参侧根发育和丹酚酸类物质生物合成的分子机制奠定了基础。8.实时荧光定量PCR测定丹参根中酚酸类物质合成通路上的15个关键酶基因的表达水平。结果表明SmSPL6过表达株系的根中,丹酚酸类物质生源途径中酶基因 SmHPPR1、SmHPPR2、SmHPPR3、Sm4CL1、Sm4CL9、SmRAS2、SmRAS4 以及SmCYP98A14的表达量显著上调。说明SmSPL6基因通过激活丹酚酸类物质合成通路上的多个酶基因的表达,从而促进丹酚酸类物质的积累。9.分析了 OE5株系转录组数据中815个差异表达基因的5’端2000 bp的启动子区含有的SBP保守结构域特异性结合的GTAC基序的个数,为后续SmSPL6靶标基因的筛选提供参考。