乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是引起女性恶性肿瘤死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells,BCSCs）是一组具有自我更新和分化潜能的肿瘤启动细胞,它们影响着肿瘤的生长速度、迁移、侵袭、复发、转移和治疗抵抗以及调控干细胞信号通路的过度激活等特征。CD44+/CD24-/low和乙醛脱氢酶1+（ALDH1+）是鉴识乳腺癌干细胞最常见的标记物。乳腺癌干细胞已成为乳腺癌治疗过程中产生耐药机制的“罪魁祸首”,并被认定为乳腺癌新疗法中的靶点。因此,研究乳腺癌干细胞特征和靶向新药及有关机制意义重大。EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition）是激活乳腺癌干细胞“干性”进而促进其生物学行为的关键步骤,肿瘤生物学行为的演进是多步骤多基因参与的过程,在转移的过程中,细胞往往发生上皮向间质的转化即EMT。肿瘤浸润、转移生物学行为等特征首发环节是原来完整的上皮结构的破坏并获得间质细胞特性,即上皮-间质转化。肿瘤细胞发生EMT伴随着上皮标记分子的下调和间质分子的上调,增强了迁移、侵袭和转移能力,同时在肿瘤复发和耐药过程中也发挥重要作用。EMT发生过程中会激活干细胞特征,发生EMT的肿瘤细胞具有干细胞样的特征。Annexin a1（AnxA1）属于结构上同源的钙离子依赖性磷脂结合蛋白超家族,分布于各种细胞类型。它能够调节细胞运输、吞噬、激素分泌、增殖、凋亡和细胞分化等各种生物学行为。越来越多的证据表明,AnxA1参与许多肿瘤的肿瘤形成、浸润和转移,表达的差异取决于肿瘤的类型,其上调表达可见于胰腺癌、肝癌和神经胶质瘤等,下调表达见于前列腺癌、食道癌和喉癌等。然而,AnxA1在乳腺癌中的确切作用仍不清楚,AnxA1对乳腺癌干细胞的调节作用需要进一步阐明。膳食中的某些天然化合物可以直接靶向癌干细胞自我更新和分化。大量的流行病学证据显示以植物为基础的饮食和癌症发病率的降低具有强烈的相关性,这成为膳食中天然化合物保护细胞恶性转化的依据。乌索酸（ursolic acid,UA）是一种广泛分布于各种水果和蔬菜之中的五环三萜类化合物。近年来由于乌索酸具有抗炎、抗癌以及化学预防等复杂的生物学特性而受到广泛关注。有研究发现,UA可以通过PI3K/Akt信号转导通路抑制前列腺癌等多种肿瘤的发生发展。但关于UA对乳腺癌的作用报道相对较少,对乳腺癌干细胞的调节机制研究仍需深入。wnt信号通路在胚胎发生、肿瘤发生,以及干细胞再生中起着关键作用。wnt蛋白是一类分泌型、糖基化和棕榈酰化的肽,通过调节干细胞的分裂、迁移和干细胞龛的完整性而调节胚胎形成的各种过程。此外,wnt/β-catenin信号通路的异常活化被认为在一些人类肿瘤的发生过程中起重要的调节作用,其上调表达显示会导致肿瘤转移增加。本课题选用人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231、BALB/c小鼠乳腺癌移植瘤模型,通过体外、体内实验研究乌索酸通过AnxA1对乳腺癌干细胞的作用和对乳腺癌干细胞重要的生物学行为特征（EMT、迁移侵袭和自我更新等）的影响,以及经wnt/β-catenin信号通路调控乳腺癌干细胞机制研究。第一部分研究中发现AnxA1在MDA-MB-231细胞（恶性程度高,相当于基因分型中的三阴型）中高表达,而在MCF-7细胞（恶性程度相对低,相当于基因分型中的lumina型）中低表达,于是敲除乳腺癌细胞中的AnxA1,结果发现干扰了AnxA1后抑制了乳腺癌细胞的干性、EMT及迁移侵袭等生物学行为,AnxA1在乳腺癌中参与了EMT的过程,下调AnxA1可以通过EMT相反的过程MET降低癌细胞干性;第二部分实验可见乌索酸降低了AnxA1的表达,乌索酸处理AnxA1不同表达的乳腺癌细胞,能够抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT,降低干性,促进凋亡等作用,下调AnxA1加强了乌索酸的上述作用;第三部分体内实验发现乌索酸治疗及AnxA1下调抑制裸鼠的成瘤能力,降低乳腺癌细胞的干性,抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡;第四部分从机制方面分析了乌索酸通过下调AnxA1对乳腺癌干细胞的抑制作用的机制可能是通过影响EMT过程及wnt/β-catenin信号通路。第一部分AnxA1在乳腺癌中的表达及对癌干细胞的影响目的:探讨AnxA1在MCF-7及MDA-MB-231细胞中的表达,及下调AnxA1后,对乳腺癌干细胞自我更新能力、EMT等重要生物学行为的影响。方法:通过免疫印迹实验检测AnxA1在乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞系中的蛋白表达强弱。采用小RNA干扰的方法和慢病毒转染（sh AnxA1、sh Scramble）的方法下调AnxA1,运用实时荧光定量PCR、免疫印迹实验以及免疫荧光实验检测敲低效率。选择转染效率高的si AnxA1及sh AnxA1,通过成球实验研究AnxA1下调对乳腺癌干性的作用。通过实时荧光定量PCR、免疫印迹实验以及免疫荧光实验检测AnxA1下调对上皮间质转化的影响。通过划痕实验、Transwell（有基质胶包被）等实验方法研究AnxA1下调对乳腺癌迁移、侵袭的影响。结果:1.AnxA1的表达在乳腺癌MDA-MB-231细胞中明显增高,而在MCF-7中减低。2.乳腺癌细胞的si AnxA1瞬时转染组和sh AnxA1稳定转染组在实时荧光定量PCR、免疫印迹实验以及免疫荧光实验中的表达均明显低于无关序列对照组（NC）。3.AnxA1下调组乳腺球的数量和大小比NC组显著降低（P＜0.01）。4.实时荧光定量PCR、免疫印迹实验以及免疫荧光实验结果显示沉默AnxA1可以明显增加E-cadherin的表达,而降低Vimentin、N-cadherin和Snail的表达（P＜0.05）。5.划痕实验和Transwell实验（有基质胶包被）发现转染了AnxA1的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力显著低于无关序列NC组（P＜0.05）。结论:1.AnxA1高表达于乳腺癌MDA-MB-231细胞,低表达于MCF-7细胞。2.下调AnxA1可以降低MCF-7及MDA-MB-231细胞系癌细胞的球形成能力,使实时荧光定量PCR、免疫印迹实验以及免疫荧光实验中E-cadherin的表达增加,Vimentin、N-cadherin和Snail的表达降低,抑制划痕实验和Transwell基质胶实验中癌细胞的迁移和侵袭能力,说明下调AnxA1可以抑制乳腺癌细胞干性、上皮间质转化和迁移侵袭能力。第二部分乌索酸通过下调AnxA1影响乳腺癌干细胞及其生物学行为目的:体外实验探讨乌索酸通过下调AnxA1杀伤乳腺癌干细胞及对其生物学行为的影响及作用。方法:运用CCK-8实验检测乌索酸对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的影响以及下调AnxA1后在乌索酸的作用下下调组和对照组的细胞吸光度值。采用实时荧光定量PCR、免疫印迹实验、免疫荧光实验及流式细胞技术等对比检测各组乳腺癌细胞（DMSO+sh Scramble+、DMSO+sh AnxA1+、sh Scramble+UA+、sh AnxA1+UA+）的迁移侵袭、EMT、干细胞特性及凋亡分子的表达情况。结果:1.CCK-8实验结果显示乌索酸能够抑制乳腺癌上述两个细胞系的增殖,乌索酸作用48小时的吸光度值比24小时降低,并且随着乌索酸浓度升高（0,5,10,15,20,30 and 40μM）测量值下降,呈时间-剂量依赖关系。2.乌索酸能够降低AnxA1的蛋白表达。3.免疫印迹实验显示四组乳腺癌细胞（DMSO+sh Scramble+、DMSO+sh AnxA1+、sh Scramble+UA+、sh AnxA1+UA+）中,乌索酸作用组以及AnxA1下调组中乳腺癌细胞的E-cadherin的表达增加,而Vimentin、N-cadherin、Snail和MMP-2、MMP-9的表达降低。两者叠加组增加或降低的趋势更加明显（P＜0.05）。4.干细胞标记物（ALDH1、Oct4、Sox2）的表达在乌索酸作用组及AnxA1下调组中下降,在乌索酸和下调AnxA1协同作用下,下降更明显。5.流式细胞技术检测上述四组的早期凋亡和晚期凋亡水平（早凋:0.09%、0.84%、10.36%、15.56%）、（晚凋:2.13%、2.25%、12.17%、18.71%）,免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达趋势与之相同。结论:乌索酸能够降低AnxA1的表达、抑制乳腺癌细胞增殖、干性、EMT及迁移侵袭,促进细胞凋亡。下调AnxA1也起到了相似的作用。并且下调AnxA1强化了上述的抑制及促进作用。说明乌索酸可能通过下调AnxA1发挥抗癌作用,影响乳腺癌干细胞及其生物学行为。第三部分下调AnxA1后乌索酸对裸鼠乳腺肿瘤生长的影响目的:体内实验研究下调AnxA1后乌索酸对裸鼠乳腺成瘤能力的影响。方法:将乌索酸作用48小时后的慢病毒转染的稳定下调组和无乌索酸孵育的对照组接种于裸鼠乳房垫,并定期观察裸鼠皮下肿瘤的大小变化,绘制生长曲线,于第28天断颈法处死并解剖小鼠,取瘤、称重、量大小,并采用免疫组织化学方法检测种植瘤相关蛋白的表达情况。结果:下调AnxA1并用乌索酸治疗对肿瘤的抑制作用比对照组增强,肿瘤的重量和体积明显低于对照组（P＜0.05）。种植瘤组织中AnxA1、ki67、Oct4及Bcl2的表达下降。结论:1.成功转染了shAnxA1慢病毒表达载体,并筛选出稳定下调的shAnxA1乳腺癌细胞株。2.下调AnxA1及乌索酸治疗抑制MDA-MB-231细胞在裸鼠体内成瘤能力。3.下调AnxA1及乌索酸治疗可以降低乳腺癌细胞的干性,抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。第四部分乌索酸通过AnxA1经wnt/β-catenin信号通路调控乳腺癌干细胞生物学行为特征目的:探讨乌索酸通过下调AnxA1经wnt/β-catenin信号通路杀伤乳腺癌干细胞。方法:采用q RT-PCR、免疫印迹实验检测肿瘤细胞wnt/β-catenin中的重要分子的表达情况,免疫组织化学方法检测小鼠移植瘤中相关分子的表达情况。结果:1.q RT-PCR实验显示下调AnxA1使β-catenin表达下降。2.免疫印迹实验显示下调AnxA1或乌索酸处理降低了P-GSK和β-catenin的表达,AnxA1下调加强了乌索酸对P-GSK和β-catenin表达的削弱作用（P＜0.05）。3.下调AnxA1并用乌索酸治疗降低了移植瘤组织中Vimentin、β-catenin的表达,而提高了E-cadherin的表达。结论:乌索酸经AnxA1对乳腺癌干细胞特征的抑制作用的机制可能是通过影响EMT过程及wnt/β-catenin信号通路实现的。