天然产物是制药工业的重要来源,链霉菌是天然产物的资源宝库。迄今为止,约三分之二的天然抗生素和一系列抗癌、抗蠕虫、抗真菌和免疫抑制药物均来源于链霉菌。测序技术的发展揭示了链霉菌富含天然产物生物合成基因簇,然而,在传统的实验室条件下,这些基因簇大多处于沉默状态,因此,开发沉默基因簇激活技术对于天然产物的挖掘是有必要的。目前,基于CRISPR-Cas系统的一系列基因编辑工具在沉默基因簇激活上具有重要的地位,其中应用较为广泛的是II型CRISPR系统。然而II型CRISPR系统在链霉菌中的应用受到Cas蛋白毒性、链霉菌基因组GC含量高、链霉菌遗传操作困难等因素的影响。随着对链霉菌研究的深入,研究人员发现链霉菌属中存在的CRISPR-Cas系统大多属于I-E型,这为链霉菌基因编辑工具的开发提供了新思路。本研究旨在开发利用链霉菌I-E型CRISPR-Cas系统,通过合理设计得到链霉菌中工作的转录激活工具,使用该工具对链霉菌中沉默的生物合成基因簇进行激活进而实现天然产物的开发。本研究的主要内容如下:1.基于本课题组前期的研究数据,本研究选取Streptomyces avermitilis MA-4680的I-E型CRISPR-Cas系统进行改造。通过使用不同linker、激活亚基、启动子终止子的组合,在整合型载体上构建了8个Cascade-activator工具质粒。随后本研究将该工具整合到本课题组挖掘的具有丰富代谢资源的链霉菌S.A-14基因组中,共得到8个含激活工具的链霉菌。2.为了使Cascade-activator蛋白复合物与DNA特异性结合,本研究设计构建了具有DR-spacer-DR结构的cr RNA表达质粒,用于基因的单位点激活调控。通过在基因上游选取不同的spacer位置,有望实现基因的激活表达。3.本研究选取S.A-14中的PTM基因簇进行了激活,通过PAM序列查找,在起始密码子上游选择了三个位点进行激活。分别在8个含激活工具的链霉菌株中进行接合转移,目前共得到21株菌,菌株生长速度与野生型相当。对菌株进行平板发酵及HPLC检测发现:9株菌表现出明显激活效果,7株菌表现出微弱激活效果,5株菌无激活效果。因此,本研究的I-E型激活工具能够有效地在链霉菌中工作。