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西黄丸由牛黄（原方犀黄）、麝香、乳香、没药四味药物组成,首见于清代名医王洪绪《外科证治全生集》。具有和营消肿止痛,清热解毒散痈的作用,可用于治疗热毒蕴结所致的多种恶疾（如流注、乳岩、痰核、瘰疬、肺痈、小肠痈等）。现代临床上可用来治疗乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤,但分子机制有待阐明。复发转移是乳腺癌治疗失败的主要原因。上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）与肿瘤转移密切相关。EMT经过一系列生物学变化,丧失细胞极性和细胞间接触能力,增强了运动和侵袭能力,进而赋予了癌细胞侵袭和转移能力。在EMT过程中,上皮标志物如E钙黏素蛋白（E-cadherin）、角蛋白（Cytokeratin）等表达水平降低,间质标志物如纤连蛋白（Fibronectin）、N钙黏素蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等表达水平升高。表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）与其受体结合后,可诱导E-cadherin进入胞内,上调Snail 1或Twist的表达水平,下调E-cadherin的表达,诱导EMT表型,进而参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移。EMT状态和程序性死亡配体1（programmed death ligand1,PD-L1）信号之间存在复杂的双向调节作用。EMT与PD-L1高表达有关:EMT相关标志物如Snail和波形蛋白（Vimentin）H评分与PD-L1表达呈正相关。PD-L1的高表达通常被认为是癌症患者预后不良的预测因子,癌细胞可通过自身高表达PD-L1来逃避宿主的抗癌免疫攻击。PD-L1可与活化的T细胞表面表达的程序性死亡受体1（Programmeddeathreceptor 1,PD-1）相互作用,诱导T细胞凋亡,导致肿瘤免疫逃逸。除EMT与PD-L1有重要的双向调节作用之外,PD-L1还受到γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-y）的上调。肿瘤细胞内干扰素刺激基因高表达往往会发生化疗或免疫治疗的耐药。IFN-y与其受体结合后,激活下游JAK/STAT信号通路,IRF-1蛋白表达激活,进而诱导肿瘤细胞PD-L1的表达;而另一个干扰素刺激基因IFIT3过表达可直接促进肿瘤耐药,而敲除IFIT3基因后可减弱化疗耐药性;在乳腺癌患者中,干扰素下游的OAS1的表达也与预后不良密切相关。尽管免疫细胞中高表达的具有IFN-γ抗肿瘤作用,但肿瘤细胞内高表达的干扰素刺激基因却可以发挥促进肿瘤发生发展的作用。我们的前期结果显示,西黄丸水提液可以抑制一组下游干扰素刺激基因的表达,同时抑制乳腺癌细胞EMT过程和PD-L1表达。因此,本研究旨在进一步探讨西黄丸对乳腺癌细胞EMT的作用及分子机制;分析西黄丸抑制乳腺癌细胞PD-L1表达及对干扰素刺激基因的作用;阐明西黄丸对于单核细胞亚群比例与功能的影响。以更好地了解西黄丸抑制乳腺癌发生发展的分子机理,为西黄丸的现代化开发以及未来与肿瘤免疫治疗药物联用打下坚实基础。第一部分 西黄丸水提液抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞上皮间质转化目的:揭示西黄丸水提液对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞EMT的影响及其分子机制。方法:利用EGF刺激,诱导乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞出现EMT表型,再联用不同浓度的西黄丸水提液,Western Blot法检测肿瘤细胞EMT相关标志物及相关信号通路标志物Fibronectin、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3的表达水平。结果:100nM EGF刺激24小时后可显著升高乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞Fibronectin和p-STAT3的表达水平,诱导出EMT表型。联用西黄丸水提液后,可在乳腺癌细胞中显著下调间质细胞标志物Fibronectin的表达水平,降低STAT3的活性,抑制因EGF刺激诱导出的EMT表型。结论:在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中,西黄丸可下调STAT3的活性,并抑制由EGF诱导的EMT表型。第二部分基于中药网络药理学和基因表达谱分析西黄丸治疗乳腺癌作用机制目的:利用中药网络药理学和基因表达谱技术探讨西黄丸治疗乳腺癌的分子作用网络,进一步阐明西黄丸治疗乳腺癌的分子机理,寻找药物靶点。方法:检索网络药理学数据库,查找西黄丸的有效成分、作用靶点及乳腺癌的相关基因并进行分析;将西黄丸的有效成分作用靶点与乳腺癌的相关基因取交集,导入Cytoscape软件作“活性成分-疾病靶点图”核心靶点网络图,建立PPI网络、GO富集分析和KEGG信号通路分析。以10nM的紫杉醇（Paclitaxel,PTX）作用乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞24h,加入7.5mg/ml的西黄丸水提液作用24h后提取总RNA,进行基因芯片表达谱分析,找出差异基因,进行GO分析和KEGG通路分析。结果:网络药理学显示西黄丸的主要有效成分包括槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、鞣花酸（ellagicacid）等;主要作用靶点包括 TP53、IL6、JUN、VEGFA、MAPK1和STAT1等;信号通路包括:PI3K-Akt、肿瘤坏死因子、HIF-1、干扰素相关信号通路等;基因表达谱显示差异表达基因有OAS2、IFIT3、IFIT2、IFI44L、IFI44、FLG2、MUC17和MUC19,差异基因生物过程主要富集在:对病毒的反应,Ⅰ型干扰素信号通路、对外界生物刺激的反应、细胞对生物刺激的反应、细胞对IFN-γ的反应等。综合二者结果,我们选择干扰素通路进行下一步研究。结论:综合分析网络药理学及基因芯片表达谱结果,包括STAT1在内的一组干扰素刺激基因可能是西黄丸水提液的重要作用靶点。第三部分 西黄丸抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231免疫逃逸的分子机制目的:通过分析西黄丸对重要免疫检查点PD-L1及IFN-y诱导基因的抑制作用,揭示西黄丸对乳腺癌免疫逃逸及耐药的影响和分子机制。方法:利用流式细胞术,检测西黄丸水提液XHW（Z）、牛黄水提液NH（W）、麝香水提液SX（W）、乳香水提液RX（W）单独或在PBMC共培养体系下对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231表面PD-L1表达水平的作用。利用紫杉醇或干扰素进行诱导刺激,通过Real Time PCR法检测西黄丸全方或单药水提液对乳腺癌MCF-7 细胞、MDA-MB-23 1 中 STAT1、IFIT3、OAS1 和 IFI44 基因表达的影响。结果:在对肿瘤细胞单独给药或肿瘤细胞与人PBMC共培养条件下,7.5mg/ml XHW（Z）处理24小时可显著下调乳腺癌MDA-MB-231细胞PD-L1的表达水平（P<0.01）。0.75mg/mlMY（W）、RX（W）可显著下调乳腺癌MCF-7与PBMC共培养后PD-L1的表达水平（P<0.01）。在乳腺癌MCF-7细胞中,0.75mg/ml NH（W）、SX（W）可显著降低因IFN-γ（200ng/ml）刺激而升高的STAT1、IFIT3、OAS1、IFI44 基因表达量（P<0.01）;10nM 紫杉醇（paclitaxel,PTX）作用于乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞24h后,加入7.5mg/ml XHW（Z）作用24h,可显著地抑制因PTX诱导升高的OAS1、STAT1、IFIT3和ISG15基因表达（P<0.05）。结论:西黄丸水提液可以显著降低乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中关键免疫检查点PD-L1蛋白的表达,单药中乳香水提液对其作用最为明显。西黄丸水提液可以降低因紫杉醇或INF-γ诱导升高的STAT1、IFIT3、OAS1、IFI44等干扰素刺激基因的表达水平,验证了上述基因表达谱的结果。第四部分 西黄丸有效成分对单核细胞亚群比例及HLA-DR表达的影响目的:通过研究西黄丸有效成分对单核细胞CD14++CD16-亚群比例及HLA-DR表达的影响,了解西黄丸对于机体重要免疫细胞功能亚群活性的作用。方法:将西黄丸有效成分加入健康志愿者外周血中,流式细胞术检测XHW（Z）、XHW（W）、NH（W）、SX(W、RX（W）对单核细胞 CD14++CD16-、CD14+CD16+和CD14+CD16++不同亚群HLA-DR表达水平的影响;分析单核细胞不同亚群比例的变化。结果:7.5mg/ml XHW（Z）可以显著上调单核细胞经典群（CD14++CD16-）中HLA-DR的表达水平（P<0.01）,并显著增加CD14++CD16-HLA-DRhi的比例（P<0.01）,上调单核细胞经典群（CD14++CD16-）的比例（P<0.01）。在各个单药水提液中,RX（W）对上述二者的上调作用最为明显。结论:西黄丸全方水提液可以上调单核细胞经典群中HLA-DR的表达,并升高单核细胞经典群的比例,提示这可能是西黄丸增强免疫细胞活性的重要作用机制。综上所述,西黄丸水提液可以抑制乳腺癌细胞EMT并下调关键免疫检查点PD-L1,降低肿瘤细胞中干扰素刺激基因的表达,同时提高单核细胞HLA-DR的表达水平,这为西黄丸抑制肿瘤EMT和免疫逃逸提供了全新的分子机制,并为进一步开发西黄丸有效成分,未来与肿瘤免疫治疗药物联用提供了重要依据。