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β-地中海贫血是世界范围内常见的单基因隐性遗传病之一,是由于β珠蛋白基因发生突变引起β珠蛋白合成减少或者缺失导致的溶血性贫血。重度地贫患儿在出生大约半年后开始发病,表现为进行性加重的贫血、肝脾肿大、感染、发育迟缓、心力衰竭、肝衰竭等症状,患者如不经治疗多在5岁前死亡。人血红蛋白是由两条类α珠蛋白链和两条类β珠蛋白链组成的四聚体,在胚胎时期主要表达胎儿血红蛋白Hb F（α2γ2）,出生前后逐渐转变为成人血红蛋白Hb A（α2β2）。重新激活β-地贫患者中已经关闭的γ珠蛋白的表达可以达到治疗这类疾病的目的。BCL11A作为重要的调控γ→β珠蛋白转换开关的转录抑制因子,被认为是激活γ珠蛋白治疗β-地贫的靶点。本文主要进行了两部分的研究,一部分是根据以往文献中报道的BCL11A可能结合在HBD上游3.5kb范围内的区域,我们采用CRISPR/Cas9慢病毒文库对这段区域进行饱和突变,经过高通量测序筛选出与Hb F高表达相关的sg RNAs位点,并选择部分位点单独进行功能验证。另一部分是对BCL11A基因的红系特异增强子以及BCL11A蛋白在γ珠蛋白基因启动子上的结合位点进行单独编辑和双重编辑,根据编辑后Hb F的表达水平选择最佳的组合进行优化和基因编辑的脱靶检测。主要研究结果如下:1.构建了靶向HBD上游3.5kb区域的CRISPR慢病毒文库,感染HUDEP-2细胞后对Hb F高/低表达的细胞进行高通量测序,获得了所有sg RNA对应的Hb F Score。针对HBD基因上游3.5kb的区域,我们设计了正反方向所有可能的sg RNA共1,084条。将合成的g RNA克隆到CRISPR慢病毒载体中,经质检合格后包装成慢病毒颗粒。以MOI:0.4的感染复数感染HUDEP-2细胞,经增殖、药筛和红系诱导分化后,流式分选出Hb F表达最高和最低的细胞各10%,经高通量测序和质控后,计算出每个sg RNA对应的Hb F socre并绘图,结果展示了HBD上游3.5kb区域对于珠蛋白转换开关调控作用的复杂性。2.筛选了7个sg RNA在HUDEP-2细胞和CD34+细胞两种模型中进行了表型验证,构建了大量HUDEP-2单克隆突变细胞株并进行了功能验证。根据sg RNA在基因组上的位置和Hb F socre,首先我们挑选了4个sg RNA进行验证,其中sg0347和sg0349位于HBD基因上游大约2.5kb处的潜在BCL11A蛋白结合基序附近,sg0801和sg0877位于PYR序列上。在慢病毒感染细胞后,我们绘制了细胞增殖曲线并用流式分析了细胞凋亡率（仅对HUDEP-2细胞）,发现sg0347和sg0349对脐血来源的CD34+细胞和HUDEP-2细胞的增殖均有显著的抑制作用,并且几乎检测不到靶位点突变。经过脱靶预测分析发现这2个sg RNA靶向的位点正好处于Alu元件上,因此导致了严重的脱靶和细胞凋亡。另外两个靶向PYR区域的sg0801和sg0877对CD34+细胞和HUDEP-2细胞的增长有轻微抑制作用,并且编辑效率不高。在编辑后的HUDEP-2细胞中,经实时荧光定量PCR（Quantitative real-time fluorescence PCR,q PCR）检测发现促进了HBG的表达。然后我们又根据sg RNA的reads count挑选了3个sg RNA,分别是sg0127、sg0596和sg0657。以慢病毒为载体对CD34+细胞和HUDEP-2细胞进行了基因编辑后,3个sg RNA对细胞增殖没有影响,并且编辑效率较高,尤其是在HUDEP-2细胞中达到70%左右的靶位点突变率。我们用流式检测了HUDEP-2细胞的红系表面标志物、细胞凋亡率,q PCR和流式分别检测了CD34+和HUDEP-2细胞珠蛋白的m RNA和蛋白表达水平。在不影响红系分化的前提下,γ珠蛋白基因的m RNA和蛋白有轻微但不稳定的升高。我们又针对sg0127、sg0596和sg0657组构建了大量的HUDEP-2单克隆细胞株,发现有些单克隆出现了γ珠蛋白基因和Hb F蛋白表达的剧烈升高,其中sg0127导致的-6 bp纯合突变表现出Hb F高表达,纯合突变+1 bp的Hb F表达降低。经过转录因子预测,我们推测缺失6 bp可能导致NF-Y转录因子的结合失败,从而促进γ珠蛋白的表达。3.在两种细胞模型中,双重基因编辑对胎儿血红蛋白Hb F的促进作用均优于单基因编辑,且没有检测脱靶现象。针对反式转录因子BCL11A的红系特异增强子h+58及其在HBG启动子区的结合基序,我们分别选择了靶向HBG启动子区的sg P1、sg P2和BCL11A增强子区的sg E1、sg E2。对HUDEP-2进行初步的单基因编辑后,我们选择效果更好的sg P1和sg E1作为双编辑组合,在HUDEP-2和成人外周血来源的CD34+两种细胞模型上进行验证,结果表明双编辑sg P1+E1对γ珠蛋白的促进效果优于单编辑sg P1和sg E1。经过优化HUDEP-2中的基因编辑效率,表达Hb F细胞的比例可达50%以上。我们在CD34+细胞上进行了扩增子深度测序和全基因组测序,未检测到脱靶,表明双基因具有良好的安全性。综上,本研究一方面通过CRISPR文库对HBD上游3.5kb的高通量筛选和单独验证,展示了这段区域对珠蛋白转换开关调控的复杂作用,并发现一个可能由转录因子NF-Y参与的珠蛋白转换开关的调控位点。另一方面验证了双基因编辑对于γ珠蛋白表达的提升效果优于单基因编辑,为β-地贫的基因治疗提供了一个新的策略。