【摘 要】
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目的:研发出一种基于CRISPR-Cas9基因编辑、滚环扩增（RCA）和G4 DNA模拟酶催化放大比色检测非小细胞肺癌（NSCLC）特异性循环肿瘤DNA（ctDNA）EGFRT790M的新方法。方法:设计与构建基于CRISPR-Cas9靶向识别剪切目标ctDNA（EGFR T790M）、RCA扩增及G4-hemin DNA模拟酶催化放大策略比色检测新方法。在构建检测新方法中,对关键实验步骤使用电泳
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.82160409）； 贵州省科技计划项目（黔科合基础[2018]1196）； 重庆市自然科学基金（cstc2018jcyj AX0201）；
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目的:研发出一种基于CRISPR-Cas9基因编辑、滚环扩增（RCA）和G4 DNA模拟酶催化放大比色检测非小细胞肺癌（NSCLC）特异性循环肿瘤DNA（ctDNA）EGFRT790M的新方法。方法:设计与构建基于CRISPR-Cas9靶向识别剪切目标ctDNA（EGFR T790M）、RCA扩增及G4-hemin DNA模拟酶催化放大策略比色检测新方法。在构建检测新方法中,对关键实验步骤使用电泳、分光光度法等表征,并进行整体方案的可行性分析。随后进行新方法的关键参数优化:包括CRISPR/Cas9与sgRNA的比例、RCA反应中phi29 DNA聚合酶的浓度、Nb.BbvCI切口内切酶的浓度、比色反应Hemin浓度、pH值以及缓冲液中的K+浓度等,以获得最佳检测条件。最后对ctDNA检测新方法进行方法学评价,主要包括:灵敏度与检测线性范围、特异性、重复性及回收率分析;并进一步收集6例非小细胞肺癌患者及4例正常人血清样本,进行临床实际样本检测。此外,对比分析本研究新方法与最近报道的ctDNA检验方法。结果:本研究成功构建了一种NSCLC ctDNA（EGFRT790M）的比色检测新方法,设计原理图中的关键步骤均成功表征。其检测体系最优条件为:Cas9和sgRNA的浓度比1:4、phi29DNA聚合酶浓度0.2U μL-1、Nb.BbvCI切口酶浓度0.3U μL-1、Hemin最佳浓度5 μmol L-1、最佳酸碱度为pH7.5、K+浓度100 mmol L-1。新方法的方法学评价显示:①其最低检测限为0.058 pmol L-1,检测线性范围为 1pmol L-1 到 2000 pmol L-1;②只有 EGFR（T790M）靶 ctDNA 序列的存在才能激活基因编辑与RCA反应,产生强烈的比色信号;③对于1、100和1000 pmol L-1三种不同浓度的靶标分子,6次独立实验的相对标准偏差为4.22%、3.25%和4.74%,表明此方法具有较好的稳定性;④在20%的正常人血清中加入5、50和500 pmol L-1浓度的靶标DNA均可检测到比色信号响应,回收率在93%～99%之间。最终,对收集到的6例非小细胞肺癌患者血清样本与4例随机正常血清样本进行ctDNA（EGFR T790M）检测,验证出新方法具有临床实际样本检测能力,并可以进行定量分析。结论:本研究成功发展出一种基于CRISPR-Cas9、RCA与G4-Hemin DNAzyme催化放大策略的NSCLC ctDNA（EGFR T790M）比色检测新方法,其具有良好的特异性、较高的灵敏度、较宽的定量分析范围以及抗干扰性强等特点,并实现了非细胞肺癌患者血清样本中的EGFR ctDNA（T790M）的有效检测,为肺癌等恶性肿瘤早期ctDNA及时检测提供新的技术工具和研究策略。
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