查尔酮合酶(ChalconeSynthase，CHS)是苯丙烷代谢途径中合成异黄酮类化合物分支途径的限速酶，催化三分子的丙二酰辅酶A和一分子的香豆酰辅酶A形成柚皮素查尔酮。柚皮素查尔酮作为下一步反应的底物，最终形成植物抗毒素(Phytoalexin，PA)等多种代谢产物，行使多种功能。因此，研究CHS基因表达调控规律具有重要的理论意义和潜在的应用价值。对CHS基因表达调控的研究主要集中在启动子结构上，其中研究得比较透彻的是豌豆查尔酮合酶1(PsCHS1)的启动子结构，然而，目前国内外有关PsCHS1基因的反式作用因子及其调控机制的研究尚属空白。 本文阐述了以PsCHS1启动子中富含AT的序列PsATRE和G-box为诱饵序列，通过酵母单杂交系统从还原性谷胱甘肽GSH诱导的豌豆上胚轴cDNA文库中筛选到3个与PsATRE互作的蛋白质因子PsATF1、PsATF2、PsATF3和1个与G-box互作的蛋白质因子PsGBF。PsATF1、PsATF2和PsATF3在GenBanK的登陆号分别为AY822466、AY822467和AY822468。 氨基酸序列分析发现，PsATF1与推测的AtbZIP51(ArabidopsisthanianabZIP51)相似性最高，全序列相似性达到54﹪；具有bZIP类转录因子的基本特征，即一个由16个氨基酸残基组成的碱性氨基酸区域，参与同DNA的结合；一个亮氨酸拉链区，与转录因子形成二聚体有关。PsATF2与拟南芥AtERF3(Arabidopsisthaniana(e)thylene-(r)esponsive(f)actor-3)相似性为59﹪；具有一个AP2结构域。PsATF3与拟南芥中一类未知功能的蛋白家族高度相似，相似性为76﹪，其氨基酸序列具有显著的核定位序列和一段碱性氨基酸区域。PsGBF属于bHLH家族蛋白，具有高度保守的碱性结构域和螺旋-环-螺旋结构，以及保守的酸性结构域。 对上述基因的表达模式分析表明，PsATF1、PsATF3和PsGBF可受GSH诱导表达，PsATF2的表达受GSH所抑制。对它们的功能研究表明，在体外PsATF1～3都能与PsATRE结合，PsGBF能与G-box结合；进而通过植物体内实验发现PsATRF1和PsATF3可激活PsATRE下游报告基因的表达，PsGBF能激活G-box下游报告基因的表达：而PsATF2则抑制PsATRE下游的报告基因的表达。另外，一些结果表明PsATF1、PsATF3和GBF能够协同作用于PsCHS1的-242～+78之间包含多种顺式作用元件的启动子区域。 我们通过构建受GSH诱导的豌豆上胚轴组织的消减文库获得了一个具有LITAF结构域的蛋白的基因PsLITAF。目前在植物中对具有LITAF结构域的基因功能的研究尚处于空白，根据基因组序列推测在拟南芥中有2个具有LITAF结构域的蛋白，水稻中有1个，但是对它们的功能研究尚未展开。我们的研究结果表明，PsLITAF可明显地受GSH诱导表达，而且主要在成熟的组织中表达，幼嫩组织中几乎不表达：在酵母中过量表达PsLITAF赋予细胞抗乙酸诱导的细胞凋亡的能力；转PsLITAF拟南芥具有抗白粉病的能力，而且转基因拟南芥愈伤组织具有抗衰老的能力；在洋葱表皮中的瞬时表达结果显示，PsLITAF定位于细胞核，同时对细胞具有保护作用。 根据上述研究结果推测豌豆上胚轴组织在受到GSH作用时，一方面可以通过激活PsCHS1的表达提高植物抗病防卫能力：另一方面可能通过启动抗凋亡机制维持细胞的生存，从而增加自己的生存机会。 目前还没有豌豆基因组序列信息，因此为了进一步研究PsATF2、PsGBF以及PsLITAF基因，需要通过染色体步行得到它们的上游和下游的调控序列。现有的基于PCR的染色体步行方法有的操作繁琐、有的步行成功率低、有的步行得到的片断太小。我们设计了一种基于随机起始和茎环结构对PCR抑制作用的染色体步查方法:SiteFind-PCR。该方法操作简单、效率高、成本低。我们使用SiteFind-PCR成功地从简单基因组样品和复杂基因组样品获得了步查超过4.5kb的片断。这为我们深入研究所获得的基因结构和功能提供了方法学支持。