论文部分内容阅读
次生维管系统的发育对木本植物的生长至关重要,该过程所产生的细胞和组织不仅能够维持树木正常的生长发育过程,还具有巨大的经济价值和生态效益。因此,探究树木维管组织的次生发育过程不仅具有重要的科学意义,还在生产方面具有良好的产业前景。前人的研究表明,植物激素油菜素甾醇可以影响植物次生维管的发育过程,促进了次生木质部的增厚。但是其对于茎维管组织次生发育的影响,包括形成层活性的变化、次生木质部变化的原因及其分子机制并没有进行深入地研究。而BZR（BRASSINAZOLE-RESISTANT）蛋白是油菜素甾醇信号传导途径中的关键因子,其蛋白活性受到上游激酶磷酸化作用的影响,调控着众多的下游基因。因此解析BZR蛋白的功能和机制有利于完善油菜素甾醇对树木茎中次生维管组织发育的调控网络。随着杨树全基因组测序的完成和遗传转化体系的完善,杨树成为林木分子遗传研究的模式物种之一。本研究首先通过生物信息学和分子生物学等手段筛选到了在杨树油菜素甾醇信号传导途径中的关键因子BZR1,再进一步通过遗传、生化等实验探究了BZR1在杨树茎维管组织次生发育中的功能和相关分子机制。本论文主要研究结果如下:（1）杨树BZR1和BZR2响应油菜素甾醇信号。通过对多个物种中BZR转录因子的进化分析,发现杨树中的BZR1和BZR2拟南芥At BZR1和At BZR2的亲缘关系最近。而拟南芥At BZR1和At BZR2是油菜素甾醇信号传导途径已解析的关键因子,这暗示了杨树BZR1和BZR2的重要性。实验结果表明油菜素甾醇信号的增强和减弱会影响2个BZR蛋白在细胞质与细胞核之间的定位变化,从而影响其对下游基因的调控作用。这表明BZR1和BZR2具有响应油菜素甾醇信号的作用,暗示其具有重要的生物学功能。（2）BZR1和BZR2在杨树茎中特异表达。为了更好地探究BZR1和BZR2的功能,对两者的组织表达特异性进行了分析。结果表明,BZR1和BZR2在杨树茎中特异表达,且BZR1和BZR2在韧皮部的表达量高于在木质部的表达量。但是,BZR1在各组织的表达量均高于BZR2,表明BZR1在茎的维管发育中可能具有主导作用。因此,选择BZR1作为后续遗传研究的对象。克隆BZR1的启动子并构建BZR1pro:GUS报告载体来转化毛白杨。转基因杨树的GUS染色结果同样证明,BZR1在茎中的表达量最高,尤其是在形成层和韧皮部的位置。（3）杨树BZR1促进维管形成层的分裂和次生木质部的分化。为了探究BZR1的生物学功能,将35S:BZR1超表达载体转入毛白杨中。与野生型相比,超量表达BZR1的转基因杨树植株高度增加,茎杆直径增粗,暗示其次生发育过程增快。茎的切片表型结果表明,BZR1的超量表达导致维管形成层的分裂活性增加,维管形成层的细胞层数增加;向次生木质部的分化增强,造成次生木质部的细胞层数和宽度增加。同时细胞周期蛋白基因CYCD3;3以及维管细胞分裂分化相关基因WOX4a、WOX14、ANT、ARK2和HB7在BZR1超表达植株中的表达水平均显著升高,与表型相符合。以上结果表明杨树BZR1促进了茎中维管形成层的分裂和次生木质部的分化。（4）筛选到一个位于油菜素甾醇信号传导途径下游的因子——PSK-α。为了筛选BZR1的下游靶基因,使用激活BZR蛋白的Bikinin试剂对杨树进行处理,将处理后的茎进行转录组测序。通过GO（Gene ontology）分析差异表达基因的功能,筛选出一组与细胞增殖（Cell proliferation）相关的差异表达基因,与BZR1导致维管形成层的分裂活性增加、形成层细胞层数增多等表型是相关联的。进一步分析发现这些差异基因大多是Phytosulfokine-α（PSK-α）小肽的编码基因,且这些基因在茎的次生维管组织中均有表达。这些结果表明,PSK-α可能在BZR1调控次生维管组织发育中扮演了重要的角色。因此选择了在茎中表达丰度最高的PSK2作为代表进行下一步的探究。（5）BZR1通过直接结合PSK2的启动子来激活PSK2的表达。通过激素处理和定量检测,发现PSK2基因的表达受到油菜素甾醇的诱导。超量表达BZR1同样导致PSK2的表达量显著上升,证明PSK是油菜素甾醇信号途径和BZR1蛋白的下游响应因子。在烟草细胞中的effector-reporter实验发现,BZR1具有激活PSK2启动子转录活性的作用。序列分析表明PSK2启动子区域具有多个BZR蛋白结合的E盒元件,暗示BZR1可能与PSK2的启动子直接结合。Ch IP-q PCR实验证明,BZR1可以直接结合到PSK2的启动子上。综上所述,BZR1可直接结合到PSK2的启动子来激活PSK2的转录表达。（6）PSK-α小肽促进杨树茎中维管形成层的分裂活性。为了探究PSK-α小肽在杨树茎中维管组织发育过程中的具体功能,用PSK-α小肽处理杨树。进行切片观察,发现PSK-α可以使茎中维管形成层细胞的分裂活性增强,导致形成层和次生木质部的细胞层数增加。这与BZR1的功能类似,进一步暗示了PSK-α是BZR1介导维管组织次生发育过程中关键的下游因子。