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目的:
汉坦病毒(hantaan virus,HV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus),主要引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合症(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。我国是HFRS高发地区,1950至2007年期间,累计发病人数超过了150万,其中46000多人死亡[1],HFRS好发人群多是青壮年,并发症多,因为HFRS机制至今仍未完全阐明,且临床上尚无特异性治疗药物,因此,疫苗的研制对HFRS防治具有重要的现实意义。
HV为单股负链RNA病毒,其核酸由大(L)、中(M)和小(S)三个基因片段组成,分别编码病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,NP)。M编码的包膜糖蛋白含有病毒的毒力位点、型特异性抗原位点、中和抗原位点以及血凝抗原位点,可刺激机体产生中和抗体,对受感染动物和人体产生保护作用,而糖蛋白的中和抗原位点主要位于G2上,推测可能是病毒分子结合宿主细胞的受体,是疫苗研究的重点[2-4]。
与HFRS相关的HV亚型有四种:HTNV、SEOV、多布拉伐病毒(dobrav virus,DOBV)和普马拉病毒(puumalavirus,PUUV),其中HTNV、SEOV是我国HFRS的主要病原体,目前,我国临床上广泛应用的是HV双价灭活疫苗,主要针对汉HTNV和SEOV而开发,由于传统疫苗存在研制周期长,保护范围窄,对发生变异的HNTV、SEOV和HV其他亚型不能起到有效的预防作用,病毒毒力“返祖”现象以及多抗原组分可能诱发的自身免疫性疾病等缺点,所以急需研制一种新型高效疫苗。由于基因工程疫苗表达量高,副效应小,又利于工业化生产,成本比传统疫苗更低廉,因此基因工程疫苗很快成为各国争相开发和生产的一种疫苗产品。
本实验采用反向疫苗学方法,利用生物信息学软件对HTNV、SEOV的包膜糖蛋白G2的抗原表位进行了分析和预测,各筛选出一段M2基因,分别插原核表达载体入pET-32a,PGEX-6P1中,诱导蛋白表达,以HFRS病人恢复期血清为一抗,通过Western-blotting检测其抗原性,为HV基因工程蛋白质疫苗的研制奠定基础。
方法:
一、两型M2基因片段的获取
利用反向疫苗学技术,对两种M2基因片段的抗原决定簇、跨膜糖蛋白等进行分析预测,确定PCR扩增的片段。设计两对引物,分别扩增HTN76-118M2和SEO SeoulBjHD01 M2片段(简称SEO M2),并利用PCR在基因的两端添加合适的酶切位点,琼脂糖凝胶电泳回收后-20℃保存。
二、构建pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2重组载体
用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切PCR产物76-118M2及pET-32a,回收76-118M2基因和开环的pET-32a质粒,用T4连接酶将二者连接,构建成pET-32a-76-118M2,转化到大肠杆菌Origami B Strains的感受态细胞中,XbaⅠ/PstⅠ双酶切鉴定后测序分析。同样方法,用限制性内切酶SalⅠ/NotⅠ双酶切PCR产物SEOM2和pGEX-6P1,回收SEOM2基因和开环的pGEX-6P1,用T4连接酶将二者连接,构建成pGEX-6P1-SEOM2,转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中,PstⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定后测序分析。
三、诱导pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表达蛋白
分别挑取单菌落,于3ml培养基中200r震荡培养过夜,以1∶50扩大培养2小时,之后加入IPTG(1mg/ml)诱导蛋白表达4h,超声破碎细菌后,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
四、 pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表达产物的抗原性分析
重组蛋白pET-32a-76-118M2,常规方法SDS-PAGE电泳,分别以His单克隆抗体和恢复期HFRS病人阳性血清为一抗进行Western-blotting,分析其抗原性。同样,重组蛋白pGEX-6P1-SEOM2,常规方法SDS-PAGE电泳,分别以GST单克隆抗体和恢复期HFRS病人阳性血清为一抗进行Western-blotting,分析其抗原性。
结果:
一、76-118M2和SEOM2基因编码蛋白质的结构特征分析
采用DNASTAR等生物软件分析,结果显示76-118M2和SEOM2基因编码蛋白质亲水性和独立抗原区域较多,柔性区域分布广,是很好的基因工程疫苗候选蛋白。
二、双型M2基因片段的获取
PCR扩增的76-118M2产物经琼脂糖凝胶电泳后获得大小约750bp条带,扩增SEOM2获得大小约800bp条带,与预期结果一致。
三、 PET-32a-76-118M2和PGEX-6P1-SEOM2重组载体的鉴定
前者经XbaⅠ/PstⅠ双酶切后,获得两个大小约为4000bp和2500bp的条带,后者经PstⅠ/EcoRⅠ双酶切后,获得两个大小约为4000bp和1800bp的条带,与预期结果一致。经序列分析,所得的结果与Genebank中相应的核苷酸序列比对,同源性达100%。
四、 pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表达蛋白的抗原性分析
原核表达产物76-118M2重组蛋白可分别与His单克隆抗体和恢复期HFRS病人阳性血清发生反应,有45kD蛋白条带,表明具有较好的抗原性。同样,原核表达产物SEOM2重组蛋白可分别与GST单克隆抗体和恢复期HFRS病人阳性血清发生反应,有56kD蛋白条带,表明具有较好的抗原性。
结论:
1.成功构建了汉坦病毒原核表达载体pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2。
2.成功诱导pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表达了蛋白
3.证明了挑选的两段基因76-118M2和SEOM2表达的蛋白具有较好的抗原性