背景:免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种自身免疫性疾病,其特征是血小板计数减少和巨核细胞抑制。众所周知,细胞介导的免疫异常参与了病理过程。与许多自身免疫性疾病一样,ITP具有辅助性T细胞1型偏向和T调节细胞活性降低。而间充质干细胞（MSCs）具有免疫调节特性,已广泛用于治疗自身免疫性疾病。ITP患者的自身间充质干细胞的免疫抑制能力可能受损,不利于疾病的治疗。基于体外细胞学实验,已经证明脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）能够显著抑制Th1细胞分泌IL-2和IFN-γ,并促进ITP中Th2细胞释放IL-4和IL-10;同时调节Th1和Th2活性之间的平衡,并上调CD4+CD25+。因此,从理论上UC-MSCs可以提高ITP小鼠的血小板计数。部分临床试验已经证明UC-MSCs输注治疗ITP有效:UC-MSCs通过可溶性细胞因子抑制ITP患者的IL-22,UC-MSCs还能够抑制活化CD4+T细胞的增殖。而且UC-MSCs的免疫调节功能与剂量呈正相关,然而高剂量的UC-MSCs与不良反应的增加有关,如急性肺栓塞的增加。因此增加单个UC-MSCs的免疫调节能力至关重要。目前业内越来越认识到三维（3D）细胞培养的优势。例如,3D培养可以通过松弛细胞骨架张力增加多能干性相关基因例如Nanog在MSCs中的表达。在3D条件下,存在多方向的细胞——基质间相互作用。3D支架的空间构象可以促进细胞之间的相互作用,增强UC-MSCs的分泌功能。此外,与2D培养的UC-MSCs相比,3D培养的UC-MSCs具有较低的免疫原性和较高的免疫抑制能力。这些结果均表明3D培养的UC-MSCs在免疫相关细胞治疗中可能具有有益的作用。我们推测,与使用2D-MSCs相比,使用3D-MSCs可以更有效地治疗ITP。为了评估这一假设,我们制备了豚鼠抗小鼠血小板血清,并将其用于构建慢性ITP小鼠模型,引起血小板持续减少,最后系统评价3D-MSCs对ITP的治疗作用。目的:1.比较二维培养和三维培养的MSCs的免疫抑制能力、抗炎性环境能力和胞外基质分泌能力。2.构建能符合临床病理特征的ITP实验模型小鼠。3.比较二维培养和三维培养的MSCs在治疗ITP模型小鼠后,动物的一般身体情况、外周血血小板计数和体内炎性环境的改变,并比较分析MSCs在体内的存活时间。方法:1.人脐带间充质干细胞的原代培养鉴定和三维培养1.1原代培养人脐带间充质干细胞:取正常妊娠足月剖宫产人脐带,剪碎后先使用胶原酶+胰蛋白酶消化贴壁培养,观察细胞形态,计算细胞倍增时间流式检测CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105的表达。1.2三维培养UC-MSCs:利用聚氟乙烯（PVF）支架对UC-MSCs进行三维培养,进行常规倒置显微镜观察、HE染色、电子显微镜和细胞组织化学染色观察。利用定量PCR检测各组MSCs细胞中免疫调节相关基因和ECM相关基因的表达水平。1.3淋巴细胞增殖抑制实验:脐血样本中分离单个核细胞（MNC）加入抗CD3单克隆抗体活化,进行抑制试验。将2D-MSCs组和3D-MSCs组以一定的比例添加活化淋巴细胞共培养,通过CCK-8比色法进行细胞计数。计算间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率。1.4体外细胞抗炎性压力实验:2D组MSCs和3D组MSCs均加入50ng/mL的IFN-γ12h以诱导可逆的炎症损伤,未经炎症因子处理的细胞作为对照组。流式检测凋亡细胞比例。2.利用间充质干细胞治疗ITP小鼠2.1 ITP小鼠模型的构建:40只BALB/c小鼠随机分为4组:正常组（Nor）、模型组（Mod）、2D-MSCs治疗组（2D）和3D-MSCs治疗组（3D）,每组10只。为了制备豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）,从BALB/c小鼠静脉血中获取血小板并多次免疫豚鼠。5周后豚鼠心脏取血制备豚鼠抗小鼠血小板血清（Guinea pig anti-mouse platelet antiserum,GP-APS）,行效价检测后以10μL/g体重的标准,从BALB/c小鼠腹腔注射GP-APS（稀释度1:4）,建立ITP小鼠模型。在第1、3、5、7、9、1 1和13天注射抗GP-APS以维持血小板的低水平。观察动物的一般情况,并记录血小板计数、脾脏/体重指数。2.2干细胞治疗:对于2D和3D组,在第15天和第17天,从尾静脉向每只小鼠输注2×10（6）/200 μL的2D或3D-MSCs进行治疗。在第21天,处死所有小鼠以测量脾脏指数和血小板浓度。检测外周血血清中的IL-10和IFN-γ水平。2.3间充质干细胞在体内的归巢和存活时间:雌性BALB/c小鼠（20±2g）随机分为2D-MSCs组和3D-MSCs组,每组6只。然后,将来自男婴的UC-MSCs静脉注射给每只小鼠2×10（6）/200 μL。在注射后6、12、24、48和72小时,在每个时间点处死三只BALB/c小鼠,并收集骨髓、肺、肝、脾和肾组织样本进行DNA扩增。基因组DNA提取试剂盒（Beyotime）被用于从不同组织中分离总基因组DNA。然后,通过qPCR检测不同组织中的人类性别决定区Y（SRY）和小鼠肌动蛋白。将每只小鼠肝脏中的SRY值设置为1。3统计学分析:所有数据均以三个单独实验的平均值±SEM表示。数据分析采用Student’t检验进行两组间比较,或采用方差分析进行多组间比较（视情况而定）。在P＜0.05时,差异具有统计学意义,全部数据使用SPSS17.0统计分析结果。结果:1.脐带间充质干细胞的三维培养及生物学特性研究1.1成功建立了UC-MSCs的原代种子细胞培养体系,完成了UC-MSCs的鉴定:本研究采用DMEM/F-12培养基和10%胎牛血清作为基础培养条件,在未添加外来细胞因子的情况下,我们从脐带中原代培养MSCs的成功率高达100%,我们利用胶原酶+胰蛋白酶的双酶消化体系,经过在聚苯乙烯为基础材质的培养皿中贴壁培养,可以快速获得细胞形态均一的成纤维样形态细胞。第4代UC-MSCs的倍增时间约为32h。经过流式细胞术鉴定,UC-MSCs阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,阴性表达CD31、CD34和CD45,符合国际对MSCs的标准。1.2 建立了 UC-MSCs的三维培养体系并完成了其生物学特性观察:我们利用聚氟乙烯三维巢状质检建立了MSCs的三维培养体系,细胞在支架上粘附良好,但细胞生长的倍增时间比二维培养延长。另外三维间充质干细胞中CD31和CD34阳性细胞的比率高于二维间充质干细胞,而CD105阳性细胞的比率低于二维培养组（P＜0.05）。1.3 3D-MSCs的免疫调控能力更强:三维培养后,所检测的所有8个免疫调控相关基因,在3D培养后的表达均高于2D培养组中的表达。其中,HLA-G、IDO1、PTGS2和TGF-β1四个基因的表达显著上调（P＜0.05）。我们通过体外与活化的淋巴细胞混合培养,进一步评估了 UC-MSCs对活化淋巴细胞增殖的抑制作用。无论共培养比率如何,在3D培养的UC-MSCs均可以更有效地抑制活化淋巴细胞的增殖（P＜0.05）。1.4 3D培养的MSCs的细胞外基质生成能力和抗应激能力增强:在3D培养的UC-MSCs表达更高水平的Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白和整合素（P＜0.05）。当MSCs输回ITP小鼠体内时,首先要面对严重的炎症环境,尤其是炎症因子的环境试验。因此,我们通过流式细胞术凋亡检测试剂盒评价3D培养能否提高MSCs抵抗炎症因子IFN-y的能力。根据预实验结果,直接选择50ng/mL的IFN-γ对MSCs进行干预。与对照组相比,该浓度的IFN-γ增加了晚期凋亡细胞的比例（P＜0.05）,但对早期凋亡影响不大。在3D组中,IFN-γ刺激不会增加早期和晚期凋亡细胞比率（与对照组相比,P＜0.05）。2.三维培养的MSCs治疗ITP模型小鼠效果更佳2.1 ITP小鼠建模:我们通过注射豚鼠抗血小板血清（GP-APS）在小鼠模型中诱导ITP。在首次注射GP-APS后,ITP模型组小鼠的活动开始下降,并伴随着食物和水摄入量的减少。对照组小鼠发育正常,反应灵活,皮毛光滑,主动觅食;在ITP模型组中,小鼠的敏捷性也显著降低,伴有大便松弛和最终体重下降（P＜0.05）。输注MSCs后,3D-MSCs组脾脏指数明显下降（与模型组相比P＜0.05,）。实验期间没有小鼠死亡。2.2三维培养的MSCs可以快速恢复ITP模型小鼠的血小板计数:注射GP-APS 24小时后,ITP模型小鼠的血小板计数显著下降,并在整个2周建模期内保持较低水平（与正常组相比,P＜0.05）。在两次MSCs治疗后,两个MSCs组的血小板计数在第21天显著增加（与模型组相比P＜0.01）,尤其是在3D-MSCs组（与模型组相比P＜0.05）。),但3D-MSCs组和2D-MSCs组之间没有显著差异。2.3三维培养的MSCs具有更好的抗炎作用:为了探讨MSCs的抗炎作用,我们检测了小鼠外周血清中细胞因子（IFN-y和IL-10）的水平。ITP模型组的血清IL-10水平低于正常组,而IFN-γ水平高于正常组（P＜0.05）。与模型组相比,MSCs治疗后,IL-10的表达增加,而IFN-y的表达显著降低（P＜0.05）,尤其是在3D-MSCs组,但3D-MSCs和2D-MSCs组之间没有统计学差异。2.4 3D-MSCs在体内存活时间更长:利用雄性婴儿的UC-MSCs进行静脉治疗,我们通过PCR检测了雄性特异性SRY基因,跟踪细胞是否能在雌性小鼠的各种组织中存活。在早期时间点,细胞主要集中在肺部,3D-MSCs组和2D-MSCs组在肺部没有显著差异。然而,3D-MSCs组的骨髓迁移率明显高于2D组（P＜0.05）。72h时,3D-MSCs组骨髓中仍检测到SRY,2D-MSCs组未检测到SRY。与2D-MSCs组相比,3D-MSCs组在脾脏和肾脏出现轻微的延迟性增加,但差异不显著。结论:1.2成功建立了 UC-MSCs的三维培养体系,并证明三维间充质干细胞中CD31和CD34阳性细胞的比率略高于二维间充质干细胞。3证明三维培养的MSCs具有更佳的免疫调控能力,其中HLA-G、IDO1、PTGS2和TGF-β1四个免疫调控基因的表达显著上调,在3D培养的MSCs可以更有效地抑制活化淋巴细胞。4 3D培养的MSCs具有更佳的细胞外基质生成能力和抗应激能力,在3D培养的UC-MSCs表达更高水平的Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白和整合素。可以更好的抵御炎症因子IFN-γ引起的凋亡。5三维培养的MSCs可以快速恢复ITP模型小鼠的血小板计数,在MSCs治疗后,小鼠血清中抑炎因子IL-10的表达增加,而炎性因子IFN-γ的表达显著降低,尤其是在3D-MSCs组。6通过PCR检测了雄性特异性SRY基因,跟踪雄性MSCs细胞在雌性小鼠的各种组织中存活时间,可以观察到3D-MSCs在体内存活时间比2D-MSCs更长。