甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）为叶酸还原酶竞争性抑制剂，目前在临床上广泛应用于宫外孕、自身免疫性疾病、白血病等治疗，但其对人体的毒副作用并未得到全面认识，尤其是对女性生殖功能的影响。目前临床上关于“MTX既往用药是否会对女性生殖功能产生长期性的损伤，该损伤会持续多久”仍处于争论之中。虽然临床上包括辅助生殖受精失败在内的许多病例提示了MTX治疗与女性生殖细胞持续性损伤之间的相关性，但对MTX诱导女性生殖能力下降的实验模型及机制研究仍属空白，所以一直缺乏说服力，当然也就没有关于避免或降低MTX损伤方法的相关报道。而虽然叶酸（folic acid,FA）以及其盐溶液一直用于妊娠期的胚胎抗畸形治疗以及MTX中毒的急救，但是目前仍没有实验可以证明FA的早期持续口服是否能在降低女性生殖功能损伤之中取得收益。
　　本项目从临床实践中发现的现象出发，旨在建立能有效模拟“MTX对女性生殖功能造成持续性损伤”这一临床现象的小鼠与细胞模型。并在该模型的基础上，从动物整体水平、细胞水平、分子水平逐步深入，对MTX导致雌性小鼠的生殖功能持续性损伤的机制进行探讨，并探究证明MTX停药后早期服用叶酸是否可以部分逆转损伤，最终为临床上降低或避免由于MTX的使用导致女性生殖功能持续性损伤提出了合理的用药建议，并为MTX的临床用药方案的改善提供一定参考。
　　首先，参考常见的临床MTX用药方式，建立MTX既往用药导致生殖功能持续性损伤小鼠模型，分别观察该模型小鼠在自然受孕和体外受精中的受精成功率及胚胎发育状况，证明该模型可模拟出MTX对雌性小鼠生殖功能的持续性损伤，损伤主要表现为受精成功率下降、胚胎发育阻滞、胚胎异常发育。同时小鼠在当前模型的建立方案处理之下，没有显著的体重下降和交配能力的丧失，这表明模型可用于后续的机制研究。
　　随后，在动物体内研究中，我们发现MTX既往用药可以引起卵巢颗粒细胞的凋亡、颗粒细胞对卵细胞生长发育相关激素分泌功能下降以及卵泡发育的阻滞，提示卵巢颗粒细胞损伤引发的卵泡发育障碍可能是小鼠生殖功能持续性损伤的重要原因。随后体外培养人的颗粒细胞，在体外验证了颗粒细胞的MTX损伤，发现MTX引起人颗粒细胞的周期阻滞、ROS系统激活、p16、p21和p53基因的激活，进而引发颗粒细胞衰老与凋亡。
　　与此同时，参考MTX的作用机制，我们尝试通过MTX停药后早期口服叶酸逆转MTX持续性生殖毒性，并在动物模型以及体外细胞实验中验证停药后叶酸添加是否可以拮抗MTX对颗粒细胞以及小鼠生殖功能的损伤。结果显示，在动物实验中，MTX停药早期的叶酸补救可以显著降低体外受精和自然受孕中小鼠胚胎的发育阻滞以及死亡、畸形。相对应的，停药早期叶酸口服，可以明显降低小鼠卵巢中的颗粒细胞的凋亡，从而恢复颗粒细胞的分泌功能，并伴随着卵泡发育过程的正常化。而体外实验也显示，叶酸的早期补充，可以明显缓解颗粒细胞的衰老、凋亡以及ROS系统的激活。
　　综上，本实验证明了MTX既往用药会引起卵巢颗粒细胞衰老、凋亡，而颗粒细胞对抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone,AMH）、雌二醇等激素分泌功能的下降，是导致卵泡发育阻滞，进而引起卵细胞发育和功能异常的重要原因，而卵细胞的发育、功能异常，是引起自然受孕以及体外受精中胚胎发育异常，即女性生殖功能持久性损伤的原因。基于以上实验结论，我们提出以下临床用药建议：1.在MTX停药后尽早补充叶酸以尽可能逆转生殖功能损伤；2.MTX用药中，密切AMH、抑制素等反应颗粒细胞功能的激素；3.MTX既往用药女性患者受孕前应同时检测颗粒细胞状态，及早做出生殖功能损伤预警。