心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）在全球范围内具有较高的患病率和死亡率,已成为影响各国社会发展的重大公共卫生问题。最新统计资料表明,我国至少有3.3亿公民面临着CVD的威胁。CVD死亡约占居民总死亡原因的40%,远超肿瘤或其他疾病。而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）导致的动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD）,如冠心病、心肌梗死、脑卒中,是导致CVD最主要的病因。AS及其并发症已成为严重影响我国国民健康的主要因素,为国家经济社会发展带来了沉重的负担。AS引起的血管管腔狭窄主要累及全身大、中动脉,导致相应器官长期缺血进而引发系统性的功能障碍或器质性损伤。脂代谢紊乱是直接导致AS发病的独立危险因素。其中,氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）诱发血管内皮细胞损伤和炎症因子等生物活性分子的释放,刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）过度增殖、迁移以及表型转换相关的血管重塑过程,最终促进动脉壁硬化和粥样斑块形成。目前,以降脂药物为基础的主流疗法虽然起到了延缓病情的效果,但并未完全阻止AS的病变进展,提示既往机制研究存在局限性。AS作为受“环境-遗传”交互作用高度影响的疾病,从表观遗传学入手探究AS相关的病理机制将会成为对经典遗传学的重要补充。非编码RNA（noncodingRNA,ncRNA）是一类重要的表观遗传调控分子,其中研究最多的微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）已被证明与AS发病的关系密切。近年兴起的环状RNA（circularRNA,circRNA）研究发现该分子具有独特的分子特点和广泛的生物学功能,其与心血管系统发育和疾病的关系也逐渐成为研究热点。因此,我们力图寻找AS疾病相关的circRNA,并对病理机制进行深入探讨,旨在扩展当前对circRNA作用分子机制的有限认识,同时为实现有效抑制AS发生发展的目标提供新的线索。第一部分环状RNA circEsyt2调控血管重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究方法:1.环状RNA circEsyt2的鉴定及在AS中的生物学作用研究1.1高脂饮食喂养Apo E敲除（Apo E-/-）小鼠建立AS动物模型,对主动脉斑块组织进行高通量测序及circRNA表达谱分析,筛选出10个显著高表达的候选circRNA。通过qRT-PCR实验进行组织表达验证,锁定AS斑块中上调幅度最大的circRNA为目标分子继续后续研究,并根据其宿主基因命名为circEsyt2。1.2评估circEsyt2的分子特性,检测核酸酶RNase R消化和放线菌素D转录抑制处理对circEsyt2以及线性RNA（GAPDH,Esyt2）表达量的影响,比较环状和线性RNA分子结构稳定性的差异。检测circEsyt2在小鼠全身主要脏器中的分布情况,以及通过核质分离和荧光原位杂交（FISH）实验观察circEsyt2在小鼠VSMC中的亚细胞定位。评估小鼠和人属circEsyt2的序列相似程度,进行物种间保守性分析。1.3 FISH实验结合免疫荧光染色（IF）分析circEsyt2在血管壁中的细胞定位,以及检测circEsyt2在AS动物（小鼠主动脉）和临床血管样本（人冠状动脉）中的表达,比较其在正常（或轻度CAD）与AS（或重度CAD）样本间的表达差异,明确circEsyt2在发挥AS相关的生物学作用中可能涉及到的血管组成细胞类型。1.4通过qRT-PCR实验检测circEsyt2在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中的表达变化,并利用FISH实验在血管平滑肌谱系示踪小鼠损伤颈动脉中进行验证,评估circEsyt2与损伤后血管重塑的关系。1.5分别构建特异敲降和过表达circEsyt2的AAV2/8腺相关病毒,在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中进行转染,在经qRT-PCR和FISH-IF实验证明干预手段的有效性和特异性的基础上,通过苏木素-伊红（HE）染色观察损伤处颈动脉内膜新生的情况,以及细胞增殖指标Ki-67染色检测细胞增殖改变,利用免疫印迹实验（Western blot）和IF实验定量血管平滑肌表型转换标志物的表达变化。1.6细胞层面上采用siRNA特异性沉默circEsyt2表达,观察人主动脉平滑肌细胞（HASMC）和小鼠VSMC增殖（CCK-8、Ed U掺入实验）、迁移（划痕和细胞小室实验）、凋亡（细胞流式实验）以及表型转换标志物（α-SMA、Calponin、Myh11）表达的改变（Western blot）,明确circEsyt2对VSMC生物学行为的调控作用。2.CircEsyt2直接结合PCBP1蛋白并调控其在胞质\胞核内分布的关系研究2.1利用生物信息学工具cat RAPID基于circEsyt2核酸序列预测结合蛋白,选择综合评分最高的蛋白即多聚胞嘧啶结合蛋白1（PCBP1）进行后续研究。2.2为证明circEsyt2与PCBP1的直接结合,我们采用生物素标记的circEsyt2探针在细胞水平上捕获实际结合蛋白（RNA pulldown实验）,经Western blot实验和蛋白质谱分析发现结合蛋白中含有PCBP1。通过RNA-蛋白质免疫共沉淀（RIP）实验用PCBP1特异性抗体反向捕获结合RNA,经qRT-PCR检测捕获下的RNA中存在circEsyt2。沉默circEsyt2后再次检测与PCBP1结合的circEsyt2量的变化,以说明两者结合具有特异性。利用FISH-IF实验观察circEsyt2与PCBP1在VSMC中的共定位.2.3通过IF实验分别在细胞以及损伤后颈动脉上敲降circEsyt2后观察PCBP1在胞内分布的改变,Western Blot检测PCBP1在胞质/胞核内表达量的变化。3.CircEsyt2通过影响p53β的生成调控VSMC增殖的机制研究3.1通过对circEsyt2沉默后的VSMC进行转录组高通量测序和基因表达谱分析,以及细胞实验验证,鉴定出受circEsyt2调控的细胞增殖相关的差异表达靶基因-PUMA和NOXA,因均属于p53信号通路,故提示circEsyt2对p53通路的调控作用。3.2通过qRT-PCR、Western blot实验检测沉默circEsyt2对p53总蛋白、乙酰化（赖氨酸382位点）水平以及可变剪接的影响,发现circEsyt2不影响p53基因转录、翻译和乙酰化修饰,但可调控p53剪接异构体p53β的生成。3.3细胞水平上观察干预p53β表达后circEsyt2对VSMC增殖调控的影响,目前p53β发挥的关键作用。4.CircEsyt2-PCBP1相互作用在剪接体p53β生成过程中的机制研究4.1利用生物信息学工具cat RAPID评估PCBP1与p53前体RNA（pre-mRNA p53）的结合可能性,通过RIP、FISH-IF实验在细胞上验证。4.2在已知PCBP1可招募剪接小体辅助因子U2AF65到前体RNA上促进基因剪接的基础上,单独或同时干预circEsyt2、PCBP1表达,RIP实验检测与U2AF65结合的pre-mRNA p53量的变化,明确circEsyt2对p53基因的可变剪接有调控作用,该作用的发挥依赖于PCBP1。4.3 RIP实验检测沉默circEsyt2后与PCBP1结合的与pre-mRNA p53量的改变,进一步明确circEsyt2与PCBP1的相互作用对p53基因可变剪接的影响。4.4通过qRT-PCR、Western blot实验检测干预PCBP1表达后circEsyt2对p53β生成调控的影响,证明PCBP1是介导circEsyt2发挥调控作用的关键调控因素。结果:1.经circRNA表达谱分析以及组织验证,我们发现并鉴定了一个在小鼠主动脉斑块组织中表达显著升高的circRNA,并根据宿主基因将其命名为circEsyt2。2.与线性转录本（GAPDH,Esyt2）相比,circEsyt2可抵抗核酸外切酶RNase R的消化作用,放线菌素D抑制细胞内基因转录后能长时间维持表达不被降解,表现出环状结构的高度稳定性。CircEsyt2在小鼠全身主要脏器中均有表达,在心血管系统的主动脉中表达相对较高。亚细胞层面上,circEsyt2大部分布于VSMC胞质。序列比对后发现小鼠与人源circEsyt2具有高度相似性。3.CircEsyt2在血管主要组成细胞（平滑肌、内皮、外膜成纤维和巨噬细胞）中均有分布,但其表达在小鼠主动脉粥样斑块和严重CAD病人的冠状动脉组织中显著上调,并且在小鼠颈动脉线损伤后的血管重塑过程中明显增加,以上变化主要体现在VSMC内。4.敲降血管中的circEsyt2后小鼠颈动脉线损伤处的内膜新生受到抑制,代表细胞增殖的Ki-67阳性率明显降低,而血管平滑肌表型标志物（α-SMA、Myh11）的表达上调。相反,过表达circEsyt2可促进颈动脉损伤处的内膜新生,细胞Ki-67阳性率升高,而表型转换标志物表达下调。细胞水平上沉默circEsyt2后,VSMC增殖、迁移能力减弱,凋亡增加,表型转换标志物表达增多。5.结合生物信息学预测和RNA pulldown、蛋白质谱和RIP等实验,我们证明circEsyt2可与PCBP1蛋白直接相互结合。6.沉默细胞或颈动脉内circEsyt2的表达后,胞质内的PCBP1表达量减少,而胞核内的表达增加。说明circEsyt2在胞质中与PCBP1蛋白直接结合并阻碍其核转位,可作为“分子开关“调控PCBP1在胞质\胞核中的分布。7.沉默circEsyt2可促进p53发生可变剪接生成p53β,从而激活p53通路中的细胞增殖相关调控基因而抑制VSMC增殖。8.PCBP1可与pre-mRNA p53直接结合,通过促进U2AF65结合到pre-mRNA p53上从而提升剪接活性而正向调控p53基因可变剪接生成p53β。9.干预PCBP1可影响circEsyt2对p53β生成的调控作用。细胞质内circEsyt2-PCBP1的相互作用影响了PCBP1的入核,并最终导致p53β的生成改变。结论:1.CircEsyt2是AS中一重要的致病分子。2.CircEsyt2通过影响VSMC的增殖、迁移、表型转换过程从而参与血管重塑的调控。3.CircEsyt2通过调控p53基因剪接异构体p53β的生成而影响VSMC的增殖。4.PCBP1与pre-mRNA p53直接结合并促进p53基因可变剪接生成p53β。5.CircEsyt2-PCBP1在胞质内的相互结合影响了PCBP1入核发挥促剪接作用。心肌梗死（myocardial infarction,MI）是主要由动脉粥样硬化引起的严重并发症之一,具有较高的院内和院外死亡率。而MI后心肌细胞的进行性丢失是导致心功能恶化和终末性心衰的基础病理表现。因此,如何减轻MI后心肌细胞损伤是防治MI后心衰的关键。心肌细胞上存在多种G蛋白偶联受体（GPCR）,例如β1肾上腺素能和脂联素受体。它们在生理状态下介导了正常心功能的维持和调节,但在MI后因过度磷酸化而失敏从而产生促心肌细胞凋亡的作用。GPCR的磷酸化水平在通常情况下受到G蛋白偶联受体激酶（GRK）的调控,但在MI后被其过度磷酸化。在7个GRK亚型中,GRK4与高血压的发病关系密切,其表达或活性升高均可通过GPCR损害肾脏正常的尿钠排泄功能。另外,人群研究结果提示,与野生型相比,带有活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）的个体表现出显著升高的3年内全因死亡、MI和卒中风险。故我们将对GRK4可能参与的MI后心肌损伤作用进行深入阐释和研究,以及对GRK4与引起心肌梗死的重要危险因素—高血压日夜节律间的关系进行初步探讨。第二部分G蛋白偶联受体激酶4在心肌梗死中的作用和关联研究方法:1.在C57BL/6J小鼠上建立MI模型,通过qRT-PCR和Western blot实验检测GRK4在心肌内的表达水平变化。2.通过免疫荧光染色检测MI后上调的GRK4在小鼠心肌细胞内的定位。3.构建心肌特异性GRK4敲除小鼠并进行MI手术,4周后用Masson染色检测心脏梗死后面积,明确GRK4在MI中的作用。4.通过M型心脏超声检测MI后心肌特异性GRK4敲除小鼠的左室射血分数（LVEF）,确定GRK4对MI后心功能的影响。5.通过PCR结合外显子测序检测GRK4各活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）在杓型和非杓型高血压患者中的分布。结果:1.GRK4在小鼠MI后的心脏组织内表达明显升高。2.MI后心肌细胞内上调的GRK4主要集中在细胞核内。3.心脏特异性敲除GRK4可缩小MI后心肌的梗死面积。4.心脏特异性敲除GRK4可改善MI后的心功能。5.在非杓型高血压患者中,GRK4活性增强突变体的携带率高达84%,各突变体与非杓型高血压间均具有正相关性。结论:1.GRK4在MI中具有致心肌损伤作用,抑制GRK4可减轻MI后的心肌损伤。2.GRK4可能通过影响核内的基因转录过程从而发挥病理学作用。3.GRK4活性突变增强体可能促进非杓型高血压的发病。大量动物实验及流行病学调查研究表明,在遗传和环境因素之外,处于胚胎发育关键期的不良子宫内环境可对子代的长期健康产生不利影响,包括增加子代成年后罹患高血压的概率。现有研究表明,暴露在孕期母代糖尿病环境下会导致胚胎编程改变,产生子代血管功能障碍并导致高血压的发生。因此,关注子宫内高血糖环境暴露对子代长期健康的影响及危害具有重要的意义。然而,由母代糖尿病/高血糖编程导致的子代高血压发病机制目前尚未完全清楚。既往大量的实验结果表明,内质网应激（endoplasmic reticulum stress）是导致高血压发病的一个重要的病理生理机制。内质网在蛋白质合成、折叠以及运输中发挥了基础而关键的作用,同时也被认为是细胞应激的初始感受器。内质网稳态和功能的损害将诱发内质网应激,导致"未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）"这一复制信号通路的激活以企图恢复内质网的稳态。然而,该通路的长期激活将干扰细胞的正常功能并导致慢性疾病如高血压的发病。另有证据表明,高血压中内质网应激也参与了血管内皮细胞功能障碍的发生,而抑制内质网应激可提升一氧化氮的生物利用度,进而改善血管内皮细胞依赖的血管舒张功能。因此,我们将对内质网应激引起的血管内皮功能障碍在母代糖尿病导致的子代高血压发病中的作用进行研究和阐释。第三部分内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）制备糖尿病孕期大鼠模型,检测母代大鼠血糖、胰岛素浓度以及评估平均动脉压、体重变化和同胎子代数与对照组的差异。2.检测糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠的体重、血压、心率、空腹血糖浓度。3.在孕期糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠中进行腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）或牛磺熊去氧胆酸（Tudca）,监测子代成年大鼠血压的变化情况。结果:1.STZ处理后孕期大鼠血糖浓度明显升高,血胰岛素浓度降低,而孕期时间、平均动脉压、体重增加和同胎子代数与对照组相比无明显差异。2.与对照母代大鼠的子代成年大鼠相比,孕期糖尿病母代大鼠的子代成年鼠体重、收缩压更高,而心率、空腹血糖水平无显著差异。3.使用内质网应激抑制剂处理孕期糖尿病母代大鼠的子代成年大鼠可抑制其血压升高,而对对照组母代大鼠的子代成年大鼠血压无明显影响。结论:1.孕期糖尿病大鼠的子代成年鼠更容易患有高血压。2.抑制内质网应激有助于改善孕期糖尿病大鼠子代成年鼠的血压。