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目的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是引起中老年人低视力和盲的主要原因之一,脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成是AMD致盲的首要原因。本课题选择玻璃膜疣所含成分—补体膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC),以激光诱导的小鼠CNV模型,观察MAC在CNV形成中的表达及作用,并用补体消耗剂蛇毒因子(cobra venomfactor,CVF)腹腔注射干预CNV形成。探索补体激活与CNV的关系,进一步阐释AMD的免疫学相关机制,为CNV的治疗提供理论依据和新方法。方法1.选择36只C57BL/6J小鼠,6-8周大,体重25-30g,雌雄不限,均经直接检眼镜、裂隙灯检查后无眼部疾病。随机分为三组,一组为对照组(n=12);二组为CVF干预组(n=12):自激光光凝前2天及激光光凝后,每天对小鼠腹腔注射0.1μg/gCVF;三组为单纯激光光凝组(n=12)。2.CNV模型制造:小鼠腹腔内注射10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉,复方托品酰胺散瞳,爱尔凯因点眼表面麻醉,实验眼结膜囊内滴适量1%甲基纤维素,眼前放置载玻片作为角膜接触镜,能量设置:氪红激光(波长647nm),光斑直径50μm,曝光时间0.1s,输出功率能量120mw,在后极部打4个激光斑,距视盘约2视盘直径,光凝后有气泡产生为击破Bruch膜的标志,直接检眼镜观察眼底激光斑。3.分别在1、3、5、7天取出眼球,行冰冻切片,利用SABC-FITC免疫荧光染色方法观察激光区域染色阳性情况,连续冠状切片后,每只眼球选取2张激光区域完整视网膜结构分别行SABC-FITC荧光染色和HE染色,每张切片随机选取5个视野(×200倍),计数每个视野中补体9(complement9,C9)的累积光密度(integratedoptical density,IOD),HE染色光镜下观察视网膜形态学变化。4.统计学方法采用SPSS 13.0统计软件,经正态性检验和方差齐性检验,满足条件后对单一处理组或单一时间点数据采用单因素方差分析,对不同处理组不同时间点数据采用双因素方差分析,用SNK法进行比较,P＜0.05具有统计学意义。结果1.HE染色1组小鼠视网膜为正常视网膜,表现为视网膜各层清晰,内外核层排列规则,视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium,RPE),Bruch膜及脉络膜结构完整。2组小鼠视网膜光凝后1天光镜下光凝区视网膜全层水肿,隆起Bruch膜和RPE层明显破坏,视网膜内、外层结构絮乱,部分缺失。光凝后3天光凝区视网膜依然水肿,隆起,可见移行增生的RPE细胞,脉络膜毛细血管充血明显,内皮细胞增生,未见新生血管形成。光凝后7天光镜下光斑区少量CNV形成。视网膜组织有水肿,轻度浆液性脱离,可见视网膜下形成瘢痕灶,瘢痕灶内有细胞排列成不规则管腔样结构,损伤部位RPE分解破碎。3组小鼠视网膜光凝后1天光镜下光凝区视网膜水肿较2组轻,余基本相同,光凝后3天光凝区视网膜依然水肿,脉络膜毛细血管充血较2组轻,光凝后7天未见新生血管生成。2.SABC-FITC组织免疫荧光染色不同处理组和不同时间点,对于小鼠C9的SABC-FITC染色的荧光强度表现不尽相同,经方差齐性检验方差齐,成正态分布。在不同处理组和不同时间点经双因素方差分析,小鼠C9的IOD差异有统计学意义(P=0.000),尚可认为各处理组和各时间点小鼠C9的IOD不同;进一步用SNK法行各组两两比较,除1,3组之间和B、C组之间小鼠C9的IOD差异没有统计学意义外(P=0.990,P=0.999),其他各组之间差异均有统计学意义(P=0.000)。在单一处理组条件下,经单因素方差分析,除1组,3组小鼠C9的IOD差异没有统计学意义外(P=1.000,P=1.000),其余组差异均有统计学意义,进一步行SNK法检验,除2组A,B与C组之间(P=0.993,P=0.924,P=0.917),小鼠C9的IOD差异没有统计学意义外,其余各组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)。在单一时间条件下,经单因素方差分析,各组差异均有统计学意义(P=0.000)进一步经SNK法检验,除各时间段*与#组小鼠C9的IOD差异没有统计学意义(P=0.995,P=0.983,P=1.000,P=0.977)外,其余各组之间差异均有统计学意义。结论本实验成功建立了激光诱导C57BL/6J小鼠脉络膜新生血管的动物模型,通过视网膜免疫荧光染色证实C9在激光诱导小鼠CNV中存在,用CVF消耗小鼠补体后,未能检测到C9的存在,也未能产生新生血管,证实补体在CNV发展中的作用,表明补体存在,MAC形成和激光诱导的CNV形成之间有相互关系。