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恶性肿瘤被视为世界性难题,严重影响着人们的生命健康。传统治疗策略无法从根本上解决肿瘤的复发和转移问题。因此,亟需开发新的肿瘤治疗策略。肿瘤及其微环境形成的机制较为复杂,与机体的基因突变密切相关。通过基因治疗能够调控相关基因的表达,修复或替换异常基因的功能,有望通过调控肿瘤及微环境相关基因来实现治疗肿瘤的目的。然而,基因治疗在体内应用仍然面临安全性、有效性以及稳定性等问题,导致目的基因不能被有效传输到肿瘤部位,降低了基因治疗的效果。高分子基因载体具有安全、低免疫原性和可大规模生产等优点,已在细胞水平上表现出高效转染效率。然而,高分子基因递送系统在体内传输过程中需要克服层层障碍,极大影响了基因传输效率。为了解决上述问题,本文一方面通过对基因载体的可逆遮蔽和引入靶向分子的策略,有效解决了高分子基因递送系统在体内循环、肿瘤部位蓄积、肿瘤组织渗透以及肿瘤细胞内吞等各阶段的生物屏障,提高了体内的传输效率。另一方面,我们利用不同治疗基因（shVEGF、shPD-L1和pHAase）以及联合依鲁替尼等策略,克服肿瘤的物理障碍并活化机体的免疫系统,实现了高效的体内抗肿瘤治疗效果。首先,我们开发了 pH敏感型基因递送系统,担载沉默血管内皮生长因子基因（shVEGF）,实现了基因物质的体内高效递送,并解决了纳米药物和免疫细胞在肿瘤部位渗透性差的物理障碍问题。我们将谷氨酸单体的羧基用丙烯醇保护得到谷氨酸丙烯酯（ALG）,再制备出谷氨酸丙烯酯-N-羧酸酐（ALG-NCA）。然后,用正己胺引发ALG-NCA开环聚合制备得到PALG,再通过Click反应将Boc保护的巯基乙胺和巯基乙酸键合到聚谷氨酸的侧链双键上,同时引入氨基和羧基,最后脱去Boc保护基团得到两性离子聚合物PAMT。我们进一步通过调节巯基乙胺和巯基乙酸比例来调节PAMT体系的电荷翻转点。通过核磁共振方法检测ALG和ALG-NCA单体的纯度,计算聚谷氨酸丙烯酯（PALG）的聚合度,以及PAMT中氨基和羧基的比例。通过GPC测量PALG以及PAMT的分子量,得到结构明确且分子量可控的聚合物。PAMT能够与PEI/pDNA复合,形成PAMT/PEI/pDNA三元复合物,在正常生理环境下（pH7.4）带负电,遮蔽体系可以有效地遮蔽PEI/pDNA复合物颗粒表面的正电荷,增加其在循环体系中的稳定性。在肿瘤酸性环境条件下（pH6.8）,实现电荷翻转,增加肿瘤组织的富集和肿瘤细胞内吞,担载shVEGF后,实现了高效抗肿瘤治疗作用。进一步,我们开发了肿瘤细胞靶向型基因递送系统,担载沉默PD-L1基因（shPD-L1）实现免疫检查点PD-1/PD-L1阻断,联合具有抗原提呈细胞靶向功能肿瘤纳米疫苗后,有效激活了机体的特异性抗肿瘤免疫响应。首先,我们在前期开发的高分子基因载体PLL-RT的基础上引入透明质酸（HA）,获得了适合体内应用的基因传递系统（HA/PLL-RT/pDNA）。为了调控肿瘤免疫耐受微环境,我们进一步构建了短发夹RNA（shPD-L1）,用于沉默肿瘤细胞膜中表达的PD-L1蛋白,阻断PD-1/PD-L1通路,提高细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。一方面,负电性的透明质酸可以遮蔽PLL-RT/shPD-L1复合物的正电荷,提高基因传递系统的体内安全性和递送效率。另一方面,透明质酸可以特异性靶向肿瘤细胞膜上过表达的CD44受体。为了进一步提高抗肿瘤作用,我们将甘露糖（Mannose）键合到PLL-RT侧链上,得到了具有树突状细胞（DC细胞）靶向性的高分子疫苗载体Man-PLL-RT,通过静电作用吸附卵清蛋白（OVA）模型抗原和未甲基化的CpG佐剂分子。总体而言,该联合治疗策略具有以下优势:（1）纳米疫苗由生物安全、可生物降解的多肽组成;（2）纳米疫苗具有DC细胞靶向能力;（3）通过基因治疗阻断PD-1/PD-L1可逆转肿瘤免疫耐受微环境;（4）联合策略可缓解和抑制肿瘤生长,为临床治疗肿瘤提供了新的思路。最后,我们开发了 shPD-L1和表达透明质酸酶质粒（pHAase）双基因调控联合Ibrutinib抗肿瘤策略,在解决肿瘤部位物理学障碍的同时激活机体的抗肿瘤免疫响应。首先,制备了肿瘤细胞靶向HA/PLL-RT/shPD-L1/pHAase双基因递送系统。实验表明,该双基因联合治疗策略有效促进了免疫细胞在肿瘤部位的浸润,提高了 CTL细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。然而,肿瘤组织免疫细胞分析结果表明,双基因治疗组的免疫抑制性细胞MDSCs和M2巨噬细胞明显增加,成为了双基因疗法的“定时炸弹”。Ibrutinib具有限制MDSCs的生成和迁移的功能,可以作为一种辅助手段来提高抗肿瘤免疫治疗效率。因此,我们进一步联合Ibrutinib来抑制MDSCs的增值和活性,以改善双基因疗法的抗肿瘤作用。双基因疗法联合Ibrutinib后取得了最佳的抗肿瘤效果,肿瘤抑制率达到91.4%。对肿瘤组织免疫细胞的分析结果显示,双基因疗法联合Ibrutinib治疗组CTL和TEM细胞显著提高,表明该策略不仅具有高效的特异性杀伤肿瘤细胞能力,且激活了免疫记忆效应,有利于长期抑制肿瘤的转移和复发。另外,免疫抑制细胞MDSCs和M2巨噬细胞的比例降至与PBS组相当甚至更低的水平,缓解了肿瘤组织的免疫抑制微环境。我们的联合治疗策略可以有效缓解和抑制肿瘤生长,并具有长期监控肿瘤的复发和转移能力,为未来的肿瘤临床治疗提供了一种新的思路。通过本论文的研究,希望能为肿瘤基因治疗开阔新的研究思路,为进一步抗肿瘤临床研究提供理论依据并奠定基础。