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慢性支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和囊性纤维化(CF)等气道炎症性疾病都是以黏液高分泌以及炎症细胞因子介导的炎症反应为特征。大量的炎症刺激因子可刺激气道分泌出大量黏液,产生的过量黏液无法正常排出导致气道阻塞。另外一些病原微生物因无法排出导致气道出现反复感染,严重影响病程的发展。以上这些是导致呼吸系统疾病较高发病率及死亡率的主要原因。黏液的主要成分是黏蛋白,黏液的过量产生伴随黏蛋白的产生增多。炎症刺激因子对黏蛋白调控机制的复杂,目前相关的研究较少,而且这些研究中多数集中于研究Th2型炎症因子IL-13对气道分泌型黏蛋白MUC5AC调控机制的研究,而几乎没有对与同类炎症因子IL-4以及其它黏蛋白如膜结合黏蛋白MUC1研究。膜结合黏蛋白MUC1能协助纤毛摆动,对粘液纤毛清除至关重要,因此对其分泌机制的相关研究,将会为气道炎症性疾病的治疗提供了新的理论参考。本实验通过Th2型炎症刺激因子IL-4诱导人支气管上皮细胞系16HBE发生炎症反应,进而通过高通量转录组测序筛选出炎症反应下相关差异基因以及差异基因所在的信号通路。再利用实时荧光定量PCR,蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验对IL-4诱导人支气管上皮细胞系16HBE黏蛋白MUC1分泌的调控机制进行研究。实验结果如下:1.通过qRT-PCR方法对不同浓度IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中TMEM16A表达进行分析,TMEM16A的表达随IL-4浓度的增加而增强,在20ng/m L IL-4刺激时作用最强。2.通过高通量转录组测序技术,筛选出20ng/m L IL-4诱导炎症反应时产生了6965个差异基因,其中上调4264个差异基因,下调2701个。3.通过分析发现大多数差异基因都参与了信号转导机制,其中涉及到305条信号通路,其中与免疫和炎症反应有关的信号有Jak/Stat Signaling(Janus激酶信号转导转录激活因子信号通路);NF-κB Signaling(核因子-κB信号通路);MAPK signaling pathway(丝裂原活化蛋白激酶信号通路);Toll-like Receptors(TLRs)Pathway(Toll样受体信号通路);B Cell Receptor Signaling(B细胞抗原受体信号通路);T Cell Receptor Signaling(T细胞抗原受体信号通路)。其中前四个是炎症反应最主要的信号通路。这些通道中的信号蛋白可能参与了气道黏蛋白MUC1的调控。4.通过qRT-PCR实验结果我们可以得出在20ng/m L IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE炎症反应时分泌的黏蛋白发生变化的有MUC1、MUC2、MUC3、MUC15、MUC16、MUC20。其中MUC1、MUC2表达上调,MUC3、MUC15、MUC16、MUC20表达下调。5.通过对20ng/m L IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE进行qRT-PCR和Western Blot TMEM16A、MUC1检测实验结果显示TMEM16A和MUC1的表达上调,TMEM16A可能参与了IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE黏蛋白MUCI的表达。通过si RNA敲除TMEM16A后,IL-4诱导16HBE细胞MUC1的分泌减少。说明TMEM16A对IL-4诱导16HBE黏蛋白MUC1的分泌起重要的调控作用。6.通过对20ng/m L IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE进行qRT-PCR和Western Blot STAT6、p-STAT6检测实验结果显示IL-4作用下p-STAT6蛋白的表达上调,说明STAT6磷酸化在反应中起作用,同时也说明STAT6可能参与了IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中TMEM16A、MUC1蛋白的表达。而用STAT6特异性性抑制剂ASAL1517499时明显减少了IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中TMEM16A、MUC1蛋白的表达增加的现象,更加证实了,STAT6参与IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中TMEM16A、MUC1的表达。7.通过对20ng/m L IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE进行Western Blot ERK1/2、p-ERK1/2检测实验结果显示IL-4作用下p-ERK1/2蛋白的表达上调,说明STAT6磷酸化在反应中起作用,ERK1/2参与了IL-4诱导黏蛋白MUC1的分泌。8.通过特异性抑制剂PD98059抑制ERK1/2对IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中TMEM16A与MUC1的影响实验结果得出使用抑制剂后TMEM16A的表达不变,减少了IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE中MUC1蛋白的表达增加的现象,说明ERK1/2作为TMEM16A下游信号参与了对IL-4诱导人支气管上皮细胞16HBE黏蛋白MUC1的表达。结论:本实验发现了IL-4诱导下能增加人支气管上皮细胞系16HBE中TMEM16A、MUC1的表达,同时IL-4对气道黏蛋白MUC1的表达是通过STAT6、ERK1/2信号蛋白所在的信号通路途经实现的。而TMEM16A可能作为中间信号分子参与了此调控过程。通过对这些信号分子的研究,能为气道炎症性黏液高分泌疾病提供新的策略和治疗靶点。