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目的:研究甲氨蝶呤及异环磷酰胺对人骨肉瘤细胞(MG-63)诱导凋亡的作用及其分子机制。方法:将MG63细胞置于37℃, 5%CO2饱和湿度的培养箱常规条件下培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化:将不同浓度的甲氨蝶呤与异环磷酰胺分别作用于MG63细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的形态变化及生长状态。2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长的抑制作用。将不同浓度的甲氨蝶呤(10 ug/ml、50 ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)与不同浓度的异环磷酰胺(5ug/ml、25 ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)分别作用于MG63细胞24h,48h,72h后加MTT10ul/孔,继续培养4h,在水平离心机上离心10min,2000rpm,弃上清液,加二甲亚砜150ul/孔,待结晶溶解后,用全自动酶标仪(波长492nm)测定每一孔的吸光度A值(OD值),并计算其细胞毒性指数值(CI),CI=(对照组A值-试验组A值)/对照组A值×100%。3制作生长曲线:根据上述药物浓度(MTT)实验处理的结果制作甲氨蝶呤与异环磷酰胺对骨肉瘤细胞株(MG-63)的生长曲线,并求出两者的IC50值。4流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布:收集分别经不同浓度的甲氨蝶呤和异环磷酰胺作用48h的MG63细胞及对照组细胞,经AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂处理后,流式细胞术检测,应用软件进行处理分析。5免疫印迹:观察甲氨蝶呤作用后的人成骨肉瘤细胞MG-63的PCNA、Cyclin-D1、Cyclin-E以及Bcl-2、Bax的表达。结果:1.细胞在倒置显微镜下的形态学变化:倒置显微镜下观察可见,未经药物处理的肿瘤细胞呈梭形贴壁生长。经IC50甲氨蝶呤处理MG63细胞24h后,细胞生长受到抑制,部分细胞变圆,折光性增强;随两者作用时间的延长,继续培养48h后可见变圆细胞逐渐增多,胞浆内颗粒增多增粗,部分细胞脱落,可见坏死细胞及碎片悬浮在培养基内;72h后部分细胞漂浮,大部细胞壁溶解,出现细胞核裸露,随后出现细胞核裂解。而经不同浓度的异环磷酰胺处理MG63细胞24h和48h后,细胞生长状态未有明显的受抑制现象,与正常对照组细胞形态相比无显著差异,表明此种药在体外对细胞的生长的抑制影响不明显。2.MTT实验不同浓度甲氨蝶呤对MG-63细胞分别作用24h、48h和72h后,对细胞的生长起到了抑制作用。将不同时间及不同浓度组与对照组相比,MTT结果显示甲氨蝶呤能明显抑制MG63细胞的增殖,甲氨蝶呤对MG-63细胞的生长抑制作用与对照组相比差异具有显著性(p<0.05),且随着药物浓度的增加及作用时间的延长抑制率也随之增加,呈剂量-时间-效应关系。不同浓度的甲氨蝶呤分别作用于MG-63细胞作用48h和72h后,MG-63细胞半数抑制率(inhibitory concentration giving 50% inhibition, IC50)分别为136.029 ug/ml和54.018 ug/ml,200ug/ml甲氨蝶呤作用MG63细胞72h后抑制率可达到74.48%(p<0.05)。不同浓度的异环磷酰胺对MG-63细胞分别作用24h、48h和72h后,测其吸光度(OD)值呈上升趋势,25ug/ml的异环磷酰胺作用于MG-63细胞分别作用24h、48h和72h后,吸光度(OD)值分别为(0.374±0.016)、(0.562±0.049)、(0.629±0.006),可见随着时间的增加,细胞数也增加,说明异环磷酰胺对MG-63生长无明显的抑制作用,与对照组相比差异不具有显著性(p>0.05)。3.流式细胞分析结果显示FCM分析发现,以50 ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的甲氨蝶呤处理MG63细胞48h后,早期凋亡百分率分别为(10.7±0.6)%、(20.4±1.9)%、(14.8±2.3)%。晚期凋亡百分率分别为(7.4±0.3)%、(22.8±3.6)%、(55.7±3.1)%。空白对照组早期凋亡百分率为(0.4±0.1)%,晚期凋亡百分率为(2.1±0.4)%.甲氨蝶呤处理组与对照组相比差异有显著性,抑制作用呈剂量依赖性。100ug/ml的异环磷酰胺处理MG63细胞48h后,G0/G1期前面未出现明显的凋亡峰, G1期细胞比例为41.0%,G2期细胞比例为17.9%,S期细胞比例为41.1%,对照组G1期细胞比例为36.2%,G2期细胞比例为22.5%,S期细胞比例为41.3%,细胞周期显示各期所占比例无明显变化,与对照组相比无显著差异。(p>0.05)4.免疫印迹结果显示PCNA、Cyclin-E在甲氨蝶呤组骨肉瘤表达与对照组相比较明显下降,Cyclin-D1略显下降趋势,Bax表达较对照组略有增加,Bcl-2表达明显减少。结论:1.本研究在倒置显微镜下观察到骨肉瘤细胞形态学变化现象显示在一定范围内随时间的增加药物对细胞的杀伤作用显著增强,而异环磷酰胺在体外对骨肉瘤MG-63细胞株无明显抑制作用,甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞株的细胞毒性作用随它们的浓度增加而增强,抗癌活性呈剂量依赖性,总体具有时间-剂量-效应关系,异环磷酰胺在体外对骨肉瘤MG-63细胞株的周期无明显影响。2.生长曲线显示甲氨蝶呤对MG-63细胞的生长有抑制作用且随着药物浓度的增加及作用时间的延长抑制率也随之增加,呈剂量-时间-效应关系。3.流式细胞分析结果显示,实验组与对照组相比,甲氨蝶呤药物处理组随着药物浓度的增加MG63细胞凋亡百分率也随之增高,而异环磷酰胺处理组在细胞各期均未见明显凋亡峰,细胞周期各期所占比例无明显变化。说明异环磷酰胺在体外对骨肉瘤细胞无明显抑制作用。4.增殖细胞核抗原(PCNA),是反映细胞增殖状态的良好指标,本实验中PCNA在甲氨蝶呤处理组表达与对照组相比较明显下降,表明甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用明显。5.本实验中将IC50甲氨蝶呤作用于骨肉瘤细胞MG63后,随着药物浓度的增加和时间的延长,CyclinD1呈下降趋势,出现cyclinE的表达量明显减少, bcl-2基因家族在控制细胞凋亡过程中也起着重要的作用,本试验甲氨蝶呤作用于骨肉瘤细胞后Bax基因表达较对照组增加明显,而Bcl-2基因表达量较对照组略有减少。