极端温度适应酶是指在极端高温或低温条件下仍能行使其催化功能的一类酶。与常温酶相比,极端温度酶的催化反应往往具有不同的热力学激活参数,但是,极端温度酶特殊热力学激活参数的结构起源仍不够清楚。本文的研究目的为:(1)在现有方法和理论的基础上建立一套获得极端温度酶催化反应热力学激活参数,即激活自由能、激活焓和激活熵的计算流程,为后续有关极端温度酶适应机理研究奠定方法学基础;(2)探索引起极端温度酶特有热力学激活参数的结构因素并鉴定出对降低激活自由能做出重要贡献的残基;(3)探讨导致嗜冷酶激活自由能降低的作用方式。本文使用的研究对象为来自胰蛋白酶类(trypsin-like)丝氨酸蛋白酶家族的嗜冷酶成员AST(anionic salmon trypsin)和常温酶成员 BT(bovine trypsin)。采用经验价键(empirical valence bond;EVB)方法,通过自由能扰动/伞状采样模拟得到两个酶在300K温度下催化反应的激活自由能(△G(?));进一步,通过不同温度条件下的EVB模拟计算,得到两个酶的高精度Arrhenius图,并最终通过回归分析得到300 K下的激活焓与激活熵。结果表明,在300 K温度条件下,嗜冷酶AST(△G(?)= 18.2±1.6kcal/mol)比常温酶BT(△G(?)=19.0±1.4kcal/mol)具有稍低的激活自由能、明显更低的激活焓(AST:AH(?)= 13.6±3.4 kcal/mol;BT:△H(?)=27.1土4.4 kcal/mol)以及更负的激活熵(AST:T△S(?)=-4.6±3.4kcal/mol;BTT△S(?)=8.1±4.4 kcal/mol),这与基于过渡态理论的预期相一致:温度的降低会导致催化反应速率的指数性下降,为了在低温下维持足够高的催化速率,低温酶会降低其激活自由能;实际上,激活自由能的降低主要是通过降低激活焓来实现的,由于AG= AH-TAS关系的存在,更低的激活焓必然会导致更低的(或更负的)激活熵。一般认为,嗜冷酶之所以能在低温条件下维持高催化活性,是因为嗜冷酶具有比常温酶或高温酶更高的构象柔性,而高柔性的存在则降低了嗜冷酶催化反应的激活焓。但是,具体是全局构象柔性、局部区域柔性还是个别氨基酸残基柔性的变化会导致催化活性的改变,具体问题尚需具体分析。为了研究单个残基主链和侧链柔性与催化活性的关系,我们选取嗜冷酶中具有最高柔性的残基Tyr97,在分别对其主链和侧链波动进行限制的条件下,计算了嗜冷酶的热力学激活参数。结果表明,当Tyr97主链的波动被限制时,嗜冷酶的热力学激活参数与缺乏限制的酶相比,几乎没有变化,但是当Tyr97残基侧链波动被限制时,嗜冷酶热力学激活参数则集体升高,表现出向常温酶参数靠拢的趋势。这一结果表明,单个(关键)残基侧链柔性(或运动能力)的保持对嗜冷酶催化活性的维持具有重要作用。激活自由能是过渡态(transition state)自由能减去反应物状态(reactant state)自由能的差,因此,激活自由能的降低有三种可能的方式:(1)反应物状态自由能不变,过渡态自由能降低(稳定过渡态方式);(2)反应物状态自由能增加,过渡态自由能不变(去稳定反应物态方式);(3)反应物状态自由能增加,而过渡态自由能降低(上述两种方式同时起作用)。为了查明嗜冷胰蛋白酶AST激活自由能降低的具体方式,我们以活性中心的“溶剂化”自由能(反应片段与周围环境的静电自由能)作为自由能的近似,计算了嗜冷酶和常温酶在反应物状态和过渡态时的自由能。结果表明,嗜冷酶和常温酶的反应物状态具有相似的自由能,而嗜冷酶的过渡态则具有更低的能量,这表明AST是通过稳定过渡态方式降低激活自由能的。最后,我们还使用局部反应场(local reaction field method;LRF)方法计算了两个蛋白酶中每个残基的静电激活自由能(即残基对激活自由能的静电贡献部分),试图鉴定出对激活自由能的降低具有最大贡献程度的残基。结果发现,在常温酶BT和嗜冷酶AST中,Gly193均具有较负的静电激活自由能值,说明它对激活自由能的降低有着重要的正贡献;而Ser214均具有最高的静电激活自由能值,说明它对酶激活自由能的降低有着重要的负贡献。通过本文的研究,我们建立了一套基于EVB方法获得酶催化反应热力学激活参数的计算流程,证明了距离催化活性中心较远的高柔性残基侧链的波动对维持嗜冷胰蛋白酶AST的催化活性具有重要作用,明确了嗜冷酶AST降低激活自由能的方式为过渡态稳定方式,并鉴定了对降低AST激活自由能有着重要贡献的关键残基。本文的结果对进一步研究嗜冷酶的低温适应机制,尤其是从热力学、动力学和能量学的角度解释酶的冷适应机制,有着重要意义;此外,本文所鉴定的关键残基对胰蛋白酶的定向改造提供了有价值的参考。