研究背景：　　 造血过程是各种血细胞的发育、成熟的过程，是一个多阶段、多步骤、受到多个因子调控涉及多个造血解剖位置的复杂而又有序的动态过程，并贯穿于生命体的一生。尽管各种血细胞组分的生理功能不同，但是它们有着同一祖先--造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。从HSCs向成熟血细胞分化的过程中，经历了造血祖细胞阶段和造血前体细胞阶段，最终分化生成所有成熟血细胞。因此，造血过程囊括两个含义：HSCs的生成过程和它的特化、增殖以及分化过程。尽管已有众多相关研究报道，但是HSCs生成、特化、增殖、分化过程以及调节机制仍不甚明确。　　 经典的模式生物如线虫、果蝇等与人类相距甚远，小鼠则是公认最好的模式生物之一。然而，由于小鼠等哺乳类动物繁殖速度较慢，且体积相对较大，胚胎子宫内发育，难以对早期造血的表型改变进行快速连续观察，因此限制了其作为高通量化学遗传学造血缺陷突变体的筛选与基因鉴定等方面的应用。斑马鱼作为脊椎动物，在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发生机制等方面均表现出与人类高度一致的特点。此外，斑马鱼还具有如体积小、生殖能力强、生殖周期短、体外受精、胚胎透明且生长迅速等独特的优势，使其成为研究脊椎动物的胚胎、组织器官发育以及与人类疾病相关的分子遗传学和发育生物学的现代模式生物，尤其特别适宜于N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)化学诱变的大规模造血系统正向遗传学突变体的筛选。并且斑马鱼心血管系统早期发育与人类极为相似，而血液和心血管系统有缺陷的突变体仍然可以存活数天，为该领域研究提供了极为有利的条件。　　 与哺乳动物类似，斑马鱼血细胞生成也分为原始造血(primitivehematopoiesis)和定向造血(definitive hematopoiesis)两个阶段，产生的分化细胞各组分与哺乳动物中发现的大多数成熟血细胞谱系类似。斑马鱼原始红细胞起源于5体节时期后部侧向中胚层(posterior lateral mesoderm，PLM)的一对双边条纹，最终在20体节(somite)时期形成对应于哺乳动物卵黄囊的中央细胞团结构(intermediate cell mass，ICM)。这里是红细胞进一步分化、成熟，进入血液循环，并于受精后5-7天(day post fertilization，dpf)成熟的地方。斑马鱼原始髓系细胞来源于10体节时期前部侧向中胚层(anterior lateral mesoderm，ALM)，主要产生巨噬细胞和中性粒细胞。早期永久HSCs于受精后26-30小时(hours post fertilization，hpf)在等同于哺乳动物AGM的背主动脉腹壁侧(ventral wall of dorsal aorta，VDA)产生。随后这些HSCs在2dpf从背主动脉腹壁侧向体后血岛(posterior blood island，PBI)迁移。最终造血干细胞在5dpf定居在肾脏，这是成年斑马鱼的造血器官。　　 斑马鱼胚胎血管系统发育起始于6hpf原肠胚形成(gastrulation)时期，此时具有双向分化功能的血液血管母细胞在腹侧中胚层分化(ventral mesoderm，VM)形成。随后，其向中轴线迁移，在12hpf到达侧向中胚层(lateral platemesoderm，LPM)，分化成为成血管细胞(angioblast)。成血管细胞约16hpf在位于内胚层背侧和脊索腹侧之间的中轴线处聚集形成索样结构，称为血管索(vasclar cord，VC)，从VC到成熟血管形成还需经历：空腔管道形成(lumenformation)，动、静脉分化选择，血流形成以及之后的血管重塑过程中细胞之间、细胞与细胞外基质连接等复杂过程。　　 本研究通过运用化学诱变剂ENU诱变野生型AB雄性斑马鱼(FO代)，繁殖F1和F2代。待F2代长大，随机挑选F2代一雄一雌成鱼交配，收集F3代胚胎，采用整体原位杂交(whole mount in situ hybridization，WISH)的方法进行大规模遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozyme C(lyC)基因缺失突变体，并详细研究了其中一个名为172的lyC基因缺失突变体在造血过程(原始造血和永久造血)中各个谱系标记物的时空表达情况，旨在分析172基因在造血过程的作用，以期进一步明确造血过程的相关分子调控机制。同时将172突变体和一种已知早期造血过程严重缺陷且尚未明确基因的突变体cloche进行表型分析比较，希望深入了解两种突变体的区别、联系以及在造血过程的作用，为cloche基因功能的全面了解、造血过程调节机制和基因定位克隆提供线索和依据。　　 研究内容共分为四个部分：第一部分ENU突变以及造血系统突变体的筛选；第二部分J72突变体的正向遗传学筛选过程；第三部分172突变体和cloche突变体表型的对比研究；第四部分造血干细胞标记物runt相关转录因子1(runtrelated transcription factor1，runxl)基因在172突变体中功能的初步研究。　　 第一部分 ENU突变以及造血系统突变体的筛选1.目的：　　 本部分将介绍斑马鱼培育和繁殖方法、ENU化学诱变以及后期大规模正向遗传学突变体筛选，目的是筛选造血系统发育缺陷的斑马鱼突变体，用于后续研究工作。　　 2.方法：　　 采用香港科技大学温子龙教授常规ENU突变方法诱变野生型AB雄性斑马鱼，依照本实验室标准斑马鱼培育技术饲养突变后成活雄鱼(F0代)，并繁殖到F2代。随机挑选一雄一雌F2代鱼交配，收集所产胚胎，于胚胎发育36hpf时期以髓系细胞标记物lyC为探针，应用WISH技术筛选lyC基因表达缺失突变体。　　 3.结果：　　 ENU突变后F0代总共12-15条鱼存活，其与野生型AB交配产下F1子代1200条，最终进行大规模正向遗传学造血缺失突变体筛选时，收集F3代36hpf时期的胚胎，应用lyC为探针进行WISH，总共筛选到4个斑马鱼lyC缺失突变体。　　 第二部分172突变体的正向遗传学筛选1.目的：　　 根据第_部分叙述，本研究在ENU突变基础上，以髓系造血细胞标记物lyC为探针，筛选到4个lyC缺失突变体。本章节详述其中一个名为172的突变体筛选过程，目的是了解筛选的具体策略以及初步了解172突变体表型，为深入分析172突变体提供线索和依据。　　 2.方法：　　 首先，采用分子生物学实验技术方法制备原位杂交RNA探针；其次，运用斑马鱼WISH技术检测lyC基因表达；之后，运用遗传学实验方法进行互补实验，将172突变体和cloche突变体交配，观察子代是否出现cloche突变体表型；最后，采用O-dianisidine染色实验(氧化还原反应)检测互补实验中胚胎3dpf时期的血红蛋白定位，以间接说明红细胞定位，明确172突变体表型。　　 3.结果：　　 WISH实验说明：36hpf时期172纯合突变体大体形态同野生型相比没有差别，但是约有近1/4的胚胎(突变体数目/总体胚胎数目=36/152)lyC基因表达缺失。观察172纯合突变体大体形态发现：在出生1天前没有明显的形态学的改变，而在1-2dpf开始约有近1/4的胚胎(突变体数目/总体胚胎数目=43/167)出现形态学变化，形态学改变如下：1)没有血液循环，但3dpf时期可以看见红细胞在VDA区域聚集；2)心脏逐渐肿大，心跳较慢，并被异常拉伸成管状；3)头较小，体长短；4)大约可以存活5-6天。互补实验结果表明：172(+/-)与cloche(+/-)交配产下的胚胎中，约有近1/4的胚胎(突变体数目/总体胚胎数目=61/233)逐渐出现与cloche纯合突变体较一致的表型，但是3dpf时期在VDA有聚集的红细胞。O-dianisidine染色实验提示：3dpf时期胚胎血红蛋白主要富集在VDA区域。同时检测21s时期172纯合突变体和cloche纯合突变体中珠蛋白亚基βe1基因表达，结果显示约有近1/4的胚胎(突变体数目/总体胚胎数目=35/148)的胚胎，即172纯合突变体，其珠蛋白亚基βe1基因mRNA表达减少；而约有近1/4的胚胎(突变体数目/总体胚胎数目=32/136)即cloche纯合突变体，其表达显著减少。　　 第三部分172突变体和cloche突变体表型的对比研究1.目的：　　 本部分重点进行了造血过程中172突变体各个谱系表型的研究，以及分析其与cloche突变体区别和联系，目的是全面了解172基因在造血过程中的功能，同时明确其与cloche基因是否具有相同或者相似的功能。另外，cloche突变体在早期血管发育方面也存在严重缺陷，为了明确172在血管发育方面是否存在缺陷，我们也简单对血管内皮标记物flk1基因的表达情况，目的是确定172基因在血管发育方面的作用。　　 2.方法：　　 主要通过采取整体原位杂交技术，针对172突变体和cloche突变体在造血过程中发育的各个阶段(原始造血和永久造血阶段)各个谱系(红系、髓系、淋巴系和干细胞)进行了详细的表型研究，同时运用O-dianisidine染色实验(氧化还原反应)检测3dpf时期172突变体和cloche突变体中的血红蛋白定位，以间接证实红细胞在两种突变体中的区别定位。　　 3.结果：　　 1)收集172杂合突变体自交和cloche杂合突变体自交各个发育阶段的胚胎用于WISH实验，突变体胚胎数目与用检测胚胎总数均近似为1/4，符合孟德尔遗传规律(详见表3-1)。　　 2)早期造血阶段scl基因表达和原始造血阶段各个谱系标记物时空表达(1)红系：检测了10s、1dpf、36hpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体的珠蛋白(globin)亚基βe1基因在mRNA水平表达情况。10s时期野生型胚胎βe1基因在ALM区域(两条条纹)表达，1dpf时期在ICM区域表达，36hpf在VDA区域表达。与同时期野生型胚胎相比，172纯合突变体的珠蛋白亚基βe1基因mRNA表达水平在各个时期均稍有减少，而cloche突变体βe1基因mRNA表达水平在各个时期均显著减少。随后，进一步检测了10s、1dpf、36hpf时期野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体早期红系发育转录调控因子gata1基因在mRNA水平表达情况。10s时期野生型胚胎βe1基因在ALM区域(两条条纹)表达，1dpf时期在ICM区域表达，36hpf在VDA区域表达。与同时期野生型胚胎相比，172纯合突变体的gata1基因mRNA表达水平在各个时期均稍有减少，而cloche纯合突变体gata1基因mRNA表达水平在各个时期显著减少。　　 (2)髓系：检测了1dpf、36hpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体的髓系表面标记物lyC、l-plastin和mpo基因mRNA水平表达情况。ldpf时期野生型胚胎lyC、l-plastin和mpo基因均在卵黄囊前部和尾部区域表达，36hpf时期主要在VDA区域表达。与同时期野生型胚胎相比，1dpf时期172纯合突变体和cloche纯合突变体的lyC基因mRNA表达缺失，1dpf、36hpf时期172纯合突变体和cloche纯合突变体的，l-plastin基因mRNA表达缺失，而1dpf、36hpf时期172纯合突变体的mpo基因mRNA表达显著减少。随后，检测了21s时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体的早期髓系表面标记物pu.1基因mRNA水平表达情况。21s时期野生型pu.1基因在“卵黄囊前部”区域表达。与同时期野生型胚胎相比，21s时期172纯合突变体和cloche纯合突变体的pu.1基因mRNA表达均缺失。　　 (3)早期造血调节转录因子scl基因：检测了10s、21s时期早期调节造血调节因子scl基因在野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体mRNA水平的表达情况。10s时期野生型胚胎scl基因在与同时期野生型胚胎相比，10s时期早期调节造血调节因子scl基因3’prime探针(scl-a和/或-β亚型)在ALM和PLM区域均有表达，5’prime探针(scl-α亚型)在PLM区域表达；而21s时期scl基因3prime探针(scl-α和/或-β亚型)在ALM、ALPM和ICM区域均有表达，5prime探针(scl-α亚型)在ICM区域表达。与同时期野生型胚胎相比，172纯合突变体scl基因(3’prime探针和5’prime探针)表达减少，而cloche纯合突变体scl基因(3’prime探针和5’prime探针)mRNA均表达缺失。　　 3)永久造血阶段各个谱系标记物时空表达(1)红系：检测了3dpf，4dpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体的珠蛋白亚基βel基因mRNA水平的表达情况。3dpf、4dpf时期野生型胚胎βel基因主要在PBI区域表达。与同时期野生型胚胎相比，172纯合突变体的βel基因主要在富集在VDA区域，且表达水平与同时期野生型表达水平无明显区别，cloche突变体βel基因在PBI表达减少。随后，进一步运用血红蛋白染色(O-dianisidine染色)方法，检测了3dpf时期172突变体和cloche突变体血红蛋白定位。3dpf时期野生型胚胎，血红蛋白除在血液循环中主要定位于PBI区域。与同时期野生型胚胎相比，172突变体血红蛋白定位在VDA区域，表达量无显著差异，而cloche主要定位在PBI，但是表达量减少。　　 (2)髓系：检测了3dpf、4dpf时期的野生型、172纯合突变体cloche纯合突变体的髓系细胞表面标记物lyC、l-plastin和mpo基因mRNA水平的表达情况。3dpf时期和4dpf时期野生型胚胎lyC、l-plastin和mpo基因在PBI区域表达。与同时期野生型胚胎相比，172纯合突变体的lyC、l-plastin和mpo基因表达在VDA区域，且表达水平与野生型表达无明显区别；而cloche纯合突变体lyC、l-plastin和mpo基因表达缺失。　　 (3)淋巴系：检测了4dpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche突变体的T淋巴细胞表面标记物rag1基因mRNA水平的表达情况。4dpf时期的野生型rag1基因在胸腺表达。与同时期野生型胚胎相比，4dpf时期172纯合突变体和cloche纯合突变体的rag1基因表达缺失。　　 (4)HSCs标记物：检测了36hpf、3dpf、5dpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体中HSCs表面标记物c-myb基因mRNA水平的表达情况。36hpf时期野生型胚胎c-myb基因在VDA区域表达，3dpf和4dpf时期c-myb基因主要在PBI区域表达。36hpf时期172纯合突变体c-myb基因在VDA区域有少量表达，3dpf、5dpf时期172纯合突变体的c-myb基因依然在VDA区域表达。与同时期野生型胚胎相比，36hpf时期172纯合突变体c-myb基因mRN，A表达显著减少，3dpf、5dpf时期172纯合突变体的c-myb基因表达减少，但是减少的程度不及36hpf时期；而36hpf、3dpf、5dpf时期cloche纯合突变体c-myb基因表达缺失。同时，还检测36hpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体的HSCs另一个表面标记物runx1基因mRNA水平的表达情况。36hpf时期野生型胚胎runx1基因在VDA区域表达。与同时期野生型胚胎相比，36hpf时期172纯合突变体和cloche纯合突变体runx1基因表达缺失。　　 4)血管内皮标记物flk1时空表达情况检测了21s、1dpf和2dpf时期的野生型、172纯合突变体和cloche纯合突变体中血管标记物flk1基因mRNA水平的表达情况。21s时期野生型胚胎flk1基因在背主动脉(dorsal aorta，DA)和后部尾静脉(posterior cardinal vein，PCV)表达，1dpf时期ISV开始表达，2dpf时期背部纵向吻合血管(dorsal longitudinalanastomotic vessels，DLAV)开始表达。与同时期野生型胚胎，172突变体flk1表达较少，血管内皮可以生成但是无法连接形成管道，而cloche突变体仅在尾部有表达，在其它血管表达缺失。　　 第四部分造血干细胞标记物runx1基因在J72突变体中功能的初步研究1.目的：　　 永久造血过程中172突变体中有红细胞和髓系细胞在VDA区域富集，但是尚不清楚这些细胞是否是永久造血过程产生。为此，设计实验来证实这些细胞来源以及明确造血干细胞标记物runx1基因在172突变体中的作用。　　 2.方法：　　 将172杂合突变体(+/-)和runx1纯合突变体(-/-)杂交，饲养下一代，待其发育成熟筛选出172基因和runx1基因都为杂合突变体，即172(+/-)runx1(+/-)。随机挑选一雄一雌，收集3dpf时期胚胎，利用runx1基因型检测方法和整体原位杂交技术，将基因型和表型一一对应，分析细胞来源。　　 4.结果：　　 1)基因型检测为172基因缺失runx1基因杂合突变体，即172(-/-)runx1(+/-)突变体lyC表达量减少；　　 2)基因型检测为172基因和runx1基因都缺失，即172(-/-)runx1(-/-)突变体lyC表达缺失；　　 3)基因型检测runx1纯合突变体，即runx1(-/-)突变体lyC表达显著减少；　　 4)基因型检测runx1杂合突变体，即runx1(+/-)突变体没有表型。　　 全文结论：　　 1)化学诱变剂ENU可以成功的诱变斑马鱼AB品系雄鱼，并且髓系血细胞标记物lyC用于原始造血阶段髓系发育缺陷的突变体筛选工作是可靠的。　　 2)筛选到的lyC缺失突变体172大体形态改变与cloche突变体基本一致，互补实验提示：172基因可能与cloche基因为同一基因，而172突变体或许是这个基因上一个新的点突变的突变体(新的等位基因点突变的突变体)。　　 3)172突变体在原始造血阶段红系造血缺陷不显著，而髓系造血过程严重障碍，并且早期造血阶段也存在部分缺陷；永久造血阶段172突变体红系髓系造血缺陷并不显著，而且髓系细胞似乎有“恢复”现象，T淋巴细胞标记物rag1基因表达缺失，提示淋巴系造血过程障碍；HSCs标记物早期表达减少，随着时间的推移HSCs出现，提示HSCs早期发育异常。clcohe突变体则表现为造血过程中所有谱系造血严重缺陷。因此推测172突变体可能是一种表现出“较弱表型”的cloche突变体。　　 4)172突变体血管内皮生成减少，并且不能连通形成管道，而cloche突变体血管内皮细胞除在尾部表达之外，其它血管内皮和心内膜均表达缺失。　　 5)runx1基因是在永久造血过程中172突变体髓系细胞生成所必需的基因，runx1基因和172基因在髓系细胞发育过程中可能存在协同作用，并且在172突变体中恢复的髓系细胞来源于永久造血过程。