背景：冠状动脉旁路移植术(CABG)是目前用于治疗冠状动脉严重狭窄性病变、改善心肌组织缺血的有效治疗方法,自体静脉是被广泛用作冠状动脉旁路移植手术的静脉血管材料,然而术后移植静脉粥样硬化性狭窄闭塞严重影响其治疗效果。血管壁炎性反应和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖、内膜增生是静脉血管桥粥样硬化再狭窄的重要特征,是多因素造成的血管壁损伤修复的渐进性病理变化过程,多项实验证实核转录因子kappa B (NF-κB)是静脉移植术后血管壁炎性反应、内膜VSMC增殖的关键核转录调节因子,因此RNA干扰技术阻断NF-κB表达,可以有效抑制炎性反应、减轻细胞增殖分化、防止移植静脉粥样硬化再狭窄的发生发展,通过基因治疗学策略抑制这种病理性增生已经成为目前研究的重点。目的：体外细胞学实验研究NF-κB p65基因的siRNA (Small interfering RNA)重组质粒脂质体复合物转染大鼠VSMC,通过VSMC细胞培养研究p65 siRNA对平滑肌细胞的增殖活性、凋亡情况及炎性细胞因子表达的影响。建立大鼠颈外静脉—腹主动脉自体静脉移植模型,动物实验研究p65 siRNA质粒脂质体转染移植静脉,检测血管组织中NF-κB p65蛋白、炎性因子TNF-α和MCP-1的表达水平,观察siRNA对炎性因子表达的阻断作用和对移植静脉血管组织VSMC增殖导致再狭窄的防治效果。方法：通过体外细胞学转染实验及大鼠移植静脉血管桥转染研究,采用RNA干扰(RNAinterference, RNAi)原理阻断NF-κB的激活,即通过siRNA达到目的基因转录后沉默,减轻炎性反应,抑制VSMC增殖,延缓移植静脉内膜增生再狭窄。一、NF-κB p65的siRNA设计合成和构建表达：根据大鼠NF-κB基因数据库中提供的其p65亚基的基因碱基序列,选定其中(5’-AAG CAC AGATAC CAC TAA GAC-31),位于NF-κB基因p65亚基mRNA的211bp-231bp处,是特异的21个碱基的寡核苷酸靶序列区,应用在线RNAi软件,此21碱基序列通过基因Blast(The Basic Local Alignment Search Tool)编码为特异的短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA),并合成其互补核苷酸链,p65寡核苷酸链煺火形成双链shRNA,然后将shRNA克隆到含有鼠源mU6启动子的载体质粒pGenesil-1.2中,质粒多克隆位点中,Sad酶切位点位于HindⅢ;和mU6 promoter之间,构建的载体质粒含有抗卡那霉素基因,转化大肠杆菌后能抵抗培养皿中卡那霉素,重组质粒转染细胞后可形成shRNA,并在核糖核酸内切酶Dicer作用下形成有功能的siRNA,重组质粒为pGenesil-1.2 p65 siRNA表达载体质粒,用试剂盒行质粒DNA的转化和扩增制备,经过专业公司：生工生物工程上海股份有限公司提取测序鉴定,即NF-κB p65 siRNA载体质粒用于本实验研究。二、体外细胞学实验：清洁级Wistar大鼠,购于山东大学医学院动物实验中心,体质量200g-300g,采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,分离切取胸主动脉,游离血管平滑肌层,采用改良的组织块贴壁法进行主动脉血管平滑肌细胞培养,将主动脉血管中膜组织剪断成约1.5*1.5mm大小组织片,约3小时后等血管组织块黏在培养瓶底部之后翻转过来,1小时后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,于5%CO2,温度为37℃的细胞培养箱中静置,差异贴壁法纯化细胞,常规胰酶消化法传代培养,用含20%胎牛血清DMEM/F12培养基孵育传代培养至第4代使用,使平滑肌细胞贴壁,每3天换液一次,预防残留组织中的成纤维细胞等去除部分杂质细胞成份,传代时将消化吹打形成的细胞悬液静置15分钟,转移培养至下一培养瓶中不断静置贴壁培养,重复后可获得纯度较高的平滑肌细胞。随后将成功传代培养的VSMC进行细胞转染试验研究,细胞随机分为正常组(A组：即正常无处理组)；对照组(B组：空白质粒脂质体复合物处理组)和转染组(C组：NF-κB p65 siRNA质粒脂质体复合物转染平滑肌细胞),使用倒置相差显微镜进行VSMC形态学观察和免疫化学染色鉴定,并观察VSMC转染效果,流式细胞仪检测细胞凋亡,MTT法检测各组培养的VSMC增殖程度情况,WesternBlotting法检测各组细胞NF-κB p65蛋白表达量的变化。三、动物模型制作及动物实验：NF-κp65 siRNA载体质粒用于动物实验研究,体质量约200g-300g左右的雄性Wistar大鼠,制作大鼠自体颈外静脉——肾下腹主动脉的血管移植模型,采用10%水合氯醛溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉,固定于手术板,颈部和腹部正中区域皮肤剃毛,消毒铺无菌孔巾,颈部切口分离右侧颈外静脉主干并结扎其多余分支,应用套管法将静脉两端翻转于18G静脉留置针片段套管中,3/0细丝线固定,缝合颈部切口；大鼠腹部正中切口后,纱布分隔肠道组织,游离并用血管夹阻断肾下腹主动脉,将翻转于套管上的颈外静脉远心端套扎固定于腹主动脉近心端,同样方法套扎吻合动、静脉另一端,开放血管夹后静脉血管桥可见明显血流充盈及搏动,依次缝合关腹。NF-κB p65 siRNA载体质粒用于动物实验研究：其中雄性Wistar大鼠60只随机分为A组：n=10,正常静脉血管；B组：n=10,单纯进行静脉移植；C组：n=20,对照质粒脂质体复合物转染移植静脉血管桥和D组：n=20,基因转染组采用NF-κB p65的siRNA质粒脂质体复合物转染移植静脉血管桥。移植静脉血管桥的siRNA质粒脂质转染：移植前采用siRNA质粒脂质体复合物1ml浸泡冲洗切取的自体颈外静脉血管20min、并30mmHg加压灌注5min,静脉血管桥吻合移植后血管外膜应用siRNA质粒脂质体复合物1ml涂抹转染,术后相应时间取静脉血管组织观察血管壁内膜中膜形态学变化,测定内膜和中膜平滑肌厚度,免疫组化检测移植血管组织增殖细胞核抗原(PCNA)水平,采用WestemBloting测定各组移植静脉血管组织中NF-κB p65蛋白的表达水平,PCR测定血管壁组织中炎性因子MCP-1和TNF-α的mRNA含量,其中PCR和WesternBloting测定过程中,内源性管家基因P-actin作为内参照,结果用于统计学分析。结果：体外细胞学实验成功培养大鼠主动脉VSMC,形态学观察可见平滑肌细胞呈特征性的峰谷状样生长,局部出现细胞聚集区,免疫化学染色鉴定VSMC,通过NF-κB p65 siRNA质粒脂质体复合物转染平滑肌细胞,WesternBloting测定细胞NF-κB p65蛋白,流式细胞仪检测VSMC细胞凋亡情况,以及MTT检测平滑肌细胞增殖活性,结果显示：C组与A、B组相比,其细胞的增殖活性明显受到抑制,凋亡细胞比例明显增多,增殖速度数量明显降低,NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05),但A组和B组之间无明显差异。动物实验研究中,各组血管组织中相关炎性因子PCR检测结果以及WesternBloting蛋白测定结果提示,术后7d,B、C和D组血管桥组织中NF-κB p65蛋白的表达水平明显高于A组静脉组织,TNF-α和MCP-1表达水平明显大于A组(P<0.05),B组与C组结果之间无明显差异,然而与C组相比,D组血管桥组织中NF-κB p65蛋白水平、炎性因子TNF-α和MCP-1的表达水平明显降低(P<0.05),提示经过siRNA质粒脂质体复合物转染处理后,D组血管桥组织NF-κB和炎性因子的表达受到明显抑制。病理组织学研究中,血管桥管壁厚度测定和PCNA细胞免疫组化检测结果可见：A组正常静脉血管壁内膜和中层厚度较薄,平滑肌细胞数较少,很少检测到PCNA阳性细胞,静脉移植术后14d,B、C组移植静脉血管桥出现内膜和中层平滑肌明显增厚,平滑肌细胞增殖活跃,大量PCNA阳性细胞主要集中于内膜及平滑肌层,动脉化程度较重,相对于B和C组血管桥,D组移植静脉血管壁内膜和中层轻度增生,内膜厚度较小,PCNA阳性细胞数降低(P<0.05),差异有统计学意义。结论：通过siRNA载体质粒体外转染VSMC,能够有效阻断NF-κB的炎性表达,减少平滑肌细胞NF-κ的激活,降低炎性因子NF-κB, MCP-1、TNF-α的表达,增加细胞凋亡,抑制VSMC的增殖活性。动物实验中,采用NF-κB p65 siRNA质粒脂质体复合物转染移植静脉,可以明显抑制血管桥组织NF-κB的激活,降低炎性因子NF-κB, MCP-1和TNF-α的表达,减轻了血管壁炎症反应,降低了移植静脉血管内膜增生和VSMC增殖程度,体内和体外实验揭示了炎性反应在静脉移植后内膜增生中的重要作用,提示siRNA治疗技术的有效性,为寻找有效、安全的基因治疗方法预防和治疗移植静脉血管桥狭窄闭塞提供了新的实验依据。