目的:虽然肥胖是2型糖尿病和心血管疾病的高危因素,但并非所有肥胖个体都伴随胰岛素抵抗,或都因肥胖而增加2型糖尿病和心血管疾病的发病风险。人感染腺病毒36型(Adenovirus type 36,Ad36)后引起体重、体脂增加,但血脂相对较低、血糖容易控制、对脂肪组织的炎症应答较低等代谢表型改变。目前关于Ad36对脂肪细胞分化与糖脂代谢通路调节的分子机制还不清楚。本课题首先以肥胖发病率较高的维吾尔族为研究对象,利用血清中和反应检测Ad36的感染率,分析维吾尔族肥胖与Ad36感染的相关性及Ad36感染后临床参数、生化指标和细胞因子表达水平的变化;其次在体外建立Ad36诱导人脂肪源性干细胞分化为脂肪细胞的模型,检测Ad36诱导对脂肪细胞代谢特征及信号通路基因表达的影响,初步探索Ad36使糖、脂良性转化的可能分子机制;最后建立Ad36与高脂饲料诱导的大鼠肥胖模型,比较体脂分布、临床生化指标、胰岛素敏感性及基因表达的异同,通过在体实验进一步探索Ad36对糖脂代谢的调节作用。方法:1)根据亚太地区成人BMI<25kg/m~2为非肥胖,BMI≥25kg/m~2为肥胖的分类标准,收集维吾尔族血清样本,利用酶法检测血糖、血脂等生化指标、ELISA检测血清脂联素(APN)浓度;血清中和反应检测研究样本血清中的Ad36抗体,并计算维吾尔族群体Ad36感染率;2)采用成脂或成骨诱导剂定向分化及流式细胞术检测细胞免疫表型鉴定人脂肪源性干细胞(hADSC);利用RT-qPCR检测E1A表达和油红O染色确定Ad36诱导的脂肪细胞模型建立;应用RNA-seq和RT-qPCR筛选并验证Ad36诱导分化的脂肪细胞差异表达的基因;3)软件预测转录因子与靶基因启动子区结合位置后,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测Ad36感染后FoxO1与PPARγ启动子区、PPARγ与下游靶基因启动子区的结合情况。收集Ad36诱导后2、4、6、8天的细胞,利用RT-qPCR和Westernblot检测Ad36诱导hADSC成脂过程中FoxO1、PPARγ、ACC、LPIN1、APN及GLUT4的表达水平的变化;4)PI3K抑制剂渥曼青霉素(WM)处理Ad36诱导的脂肪干细胞后,油红O染色检测WM对成脂的影响,利用RT-qPCR和Westernblot检测PI3K、Akt、FoxO1、PPARγ及下游靶基因的表达水平;5)分别采用高脂饲料喂养和Ad36诱导构建肥胖大鼠模型,从以下几方面分析两种诱因导致肥胖的异同:(1)利用葡萄糖氧化酶法、GPO-PAP法及放免法分别检测血糖、甘油三酯和胰岛素浓度;(2)利用IPGTT、ITT分析血糖的变化情况;(3)利用HE染色观察脂肪细胞和肝细胞形态学变化及脂质异位沉积;(4)RT-qPCR检测两种肥胖大鼠脂肪组织ACC、LPIN1、APN及GLUT4基因的表达,并综合分析不同诱因引起的肥胖对胰岛素敏感性及糖脂代谢的影响。结果:1)依据严格的纳入与排除标准共筛选维吾尔族样本185例,其中非肥胖95例,肥胖90例。利用血清中和反应检测研究样本是否感染Ad36,结果显示Ad36感染样本91例,其中肥胖患者53例,非肥胖38例;未感染Ad36者94例,其中肥胖患者37例,非肥胖57例。肥胖与非肥胖组比较,Ad36的感染率在两组间的差异有统计学意义(P<0.05),且肥胖组Ad36感染率明显高于非肥胖组。肥胖人群中,Ad36感染后TG的水平降低,与非感染组比较差异有统计学意义(P<0.05),但在肥胖人群中感染Ad36后脂联素的水平与未感染组相比升高,且差异有统计学意义(P<0.05);2)从脂肪组织分离并鉴定hADSC,hADSC在体外呈梭形贴壁生长,且能稳定传代。细胞在加入成脂、成骨诱导剂后可定向分化成脂肪细胞和成骨细胞。流式细胞术检测结果显示:造血干细胞标记抗原CD34、CD45和血小板-内皮细胞粘附分子CD31呈阴性表达,而间充质干细胞标记抗原CD44、CD105呈阳性表达。上述结果确认所分离的细胞为人脂肪源性干细胞;3)Ad36诱导后的第2到第8天细胞逐渐扁圆,细胞内脂滴逐渐增多并开始融合。RNA-seq筛选及RT-qPCR验证出参与脂肪细胞分化、脂质聚集和糖脂代谢的基因,结果显示与未感染组比较,Ad36感染后使FoxO1基因的表达降低,而PPARγ、ACC、LIPIN1、GLUT4、LPIN2、APN和FASN基因的表达显著升高,且差异有统计学意义(P<0.05);4)ChIP检测结果显示:Ad36感染使FoxO1与PPARγ启动子区DNA的结合率显著降低,提示FoxO1对PPARγ的转录抑制作用减弱。Ad36感染48小时后PPARγ与ACC、APN、LPIN1启动子区DNA的结合率显著增强,感染72小时后PPARγ与ACC、APN、LPIN1和GLUT4的结合率均增强,提示PPARγ提高了靶基因ACC、APN、LPIN1和GLUT4的转录活性。RT-qPCR和Westernblot检测上述基因表达水平,结果显示:Ad36诱导人脂肪细胞分化过程中,总FoxO1含量降低,但磷酸化FoxO1及PPARγ、ACC、APN、LPIN1和GLUT4靶基因的表达量增多;检测第0、2、4、6、8天培养基中葡萄糖的含量,显示第2、4、6、8天培养基葡萄糖浓度均降低,与第0天未感染Ad36比较,第4、6、8天培养基葡萄糖浓度降低且差异有统计学意义(P<0.05);而第6天和第8天细胞内甘油三酯的含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),并且第8天甘油三酯的含量最高;5)WM干预Ad36诱导的脂肪干细胞后,油红O染色结果显示WM使Ad36诱导脂肪细胞分化能力显著降低。Westernblot结果显示:与Ad36单独诱导组比较,WM干预后使磷酸化的Akt、磷酸化的FoxO1及PPARγ2的表达量降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR结果显示:与Ad36单独诱导组比较,WM干预后使ACC、APN、LPIN1和GLUT4mRNA表达水平降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。提示WM抑制PI3K/Akt/FoxO1/PPARγ信号通路,降低Ad36诱导脂肪细胞分化和葡萄糖的摄取的能力;6)高脂饮食或Ad36诱导均可使Wistar大鼠体重增加及内脏脂肪含量增多。但与高脂诱导的肥胖相比,Ad36诱导的肥胖大鼠血糖、血TG、胰岛素和HOMA-IR维持在正常水平,糖耐量与胰岛素耐量正常,肝脏细胞内未见脂质异位沉积。与空白对照组比较,高脂饲料喂养的肥胖大鼠脂肪组织GLUT4和APN的表达量降低;而Ad36诱导的肥胖大鼠脂肪组织GLUT4、LPIN1和APN的mRNA表达水平升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1)新疆维吾尔族肥胖人群Ad36感染率明显升高但甘油三酯水平降低,血清脂联素浓度升高,提示Ad36可能是通过上调肥胖个体脂联素的表达而使血脂出现良性转化;2)Ad36通过PI3K/Akt/FoxO1/PPARγ信号通路,增加ACC、LPIN1、GLUT4和APN的表达,使Ad36促进脂肪酸、甘油三酯的合成并改善胰岛素的敏感性;3)Ad36可能通过上调GLUT4、LPIN1和APN的表达而改善肥胖大鼠胰岛素的敏感性,并且Ad36虽然诱导大鼠肥胖,但没有出现血糖、血TG紊乱及脂质异位沉积。