研究背景:目前心血管疾病已成为危害人类健康的头号杀手,其中动脉粥样硬化更是严重危害着人们的健康,其会引起后续一系列的心脑血管疾病,例如高血压、冠心病等。近来研究发现,动脉粥样硬化斑块内的血管新生对于动脉粥样硬化的不稳定性以及发生发展,起到了关键的促进作用。动脉粥样硬化脂质斑块的高代谢性以及斑块占位造成的局部的低氧环境,会促进脂质斑块内的血管新生,动脉粥样硬化斑块中的新生血管可引起炎症细胞聚集,并能最终导致斑块破裂及出血,抑制斑块内的血管新生,成为了当今动脉粥样硬化治疗的新靶点。白藜芦醇是一种提取自葡萄类及葡萄类制品中的、具有多种生物活性的多酚类化合物,其主具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗癌等一系列的生物性作用。有研究发现,白藜芦醇能够有效抑制肿瘤细胞中的新生血管。本研究旨在探讨白藜芦醇能否通过抑制动脉粥样硬化脂质斑块中的血管新生进而延缓动脉粥样硬化的发生发展,最终达到治疗的目的,并通过细胞实验初步探究其作用机制。第一部分:SIRT1内皮特异敲除小鼠的构建目的:构建SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠及同窝SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠。方法:选取8周龄Tie2-Cre雌鼠与SIRT1^{floxed/floxed}雄鼠合笼,喂以普通饲料饮食,一只雌性Tie2-Cre鼠配一只雄性SIRT1^{floxed/floxed},待其生仔产生F1代后,鉴定基因型,挑出基因型同时具备Tie2-Cre阳性与SIRT1 ^floxed/-的小鼠继续杂交,产出F2代,挑选F2代中基因型为Tie2-Cre阳性与SIRT1 ^{floxed/floxed}的小鼠(即SIRT1 ^endo-/-)继续与Apo E^-/-合笼配对,得到子一代SIRT1 ^endo+/-Apo E^+/-,继续让子一代杂交,筛选出所需基因型为:SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-作为阳性鼠,同窝的SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-则作为阴性对照鼠。结果:SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠构建成功,并选取同窝SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠作为下一步实验的阴性对照。第二部分:白藜芦醇对小鼠动脉粥样硬化斑块内血管新生的影响目的:观察白藜芦醇对SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠及SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠动脉粥样硬化的影响。方法:选取8周龄雄性SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠及SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠各16只,按照干预方式及基因型不同分成四组:分组一:SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-（8只）,高脂喂养16周,第10周开始同时给予腹腔注射白藜芦醇（100mg/kg/d）6周;分组二:SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-（8只）,高脂喂养16周,第10周开始同时给予腹腔注射白藜芦醇（100mg/kg/d）6周;分组三:SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-（8只）,持续单纯高脂喂养16周;分组四:SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-（8只）,持续单纯高脂喂养16周。观察四组小鼠体重、血清总胆固醇（TC）、血清甘油三酯水平（TG）、血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平,并取腹主动脉做油红O染色以及HE染色观察斑块大小,VEGF免疫组化染色观察斑块内的血管新生情况。结果:SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠高脂喂养后,血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明显高于SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠水平,而给予高浓度白藜芦醇后,血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均有所降低;免疫组化结果显示,高脂喂养后,SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠及SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-血管壁均明显地增厚,内皮细胞松散,且存在缺损或不完整,内膜表面不光滑,血管内腔中出现明显的脂质斑块,其中含大量的泡沫细胞浸润,有胆固醇结晶,富含脂质,呈偏心性生长,给予高浓度白藜芦醇后,SIRT1 ^endo+/+Apo E^-/-小鼠脂质斑块大小及脂质斑块内的血管新生程度均有明显降低,而SIRT1 ^endo-/-Apo E^-/-小鼠脂质斑块大小及脂质斑块内的血管新生均无明显改善。第三部分:高浓度的白藜芦醇对于内皮细胞的作用影响目的:初步探究白藜芦醇抑制动脉粥样硬化脂质斑块内的血管新生的可能机制。方法:选取人脐静脉内皮细胞系（HUVECs）做离体细胞实验,H₂O₂来诱发内皮细胞氧化应激,sh-SIRT1用来沉默内皮细胞中的SIRT1的表达,共分6组:对照组,H₂O₂处理组,H₂O₂+白藜芦醇干预组,sh-SIRT1组,sh-SIRT1+H₂O₂处理组,sh-SIRT1+H₂O₂+白藜芦醇干预组。流式细胞计数观察内皮细胞凋亡情况,Western blot检测内皮细胞中SIRT1,HIF-1α和VEGF的表达。同时,观察不同剂量的白藜芦醇对于HUVECs生长及迁移的影响。结果:H₂O₂能诱导HUVECs氧化应激,并且,HIF-1α和VEGF的表达也增加,而SIRT1的表达明显降低（P<0.05）。当给予高浓度的白藜芦醇后,能逆转上述变化,而在sh-SIRT1+HO组,则没有这样的逆转效果。此外,高浓度白藜芦醇能通过促进内皮细胞凋亡抑制HUVECs迁移（P<0.05）。研究结论:1、高浓度的白藜芦醇能够抑制动脉粥样硬化小鼠血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C,并能够抑制脂质斑块内的血管新生,进而延缓小鼠动脉粥样硬化的发生发展。2、高浓度的白藜芦醇通过激活内皮细胞SIRT1,抑制HIF-1α以及VEGF表达产生抑制动脉粥样硬化脂质斑块中的血管新生的作用。