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目的:骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）是异质性克隆性髓系恶性肿瘤,在血液系统疾病中发病率极高,且极难治愈,10年生存率不足5%,特别是复发难治性和大于60岁的老年患者[1]。MDS中多存在DNA高甲基化（DNA methylation）,抑癌基因失活,近年来学者们对表观遗传学的研究高度重视,发现甲基化修饰可以被逆转[2]。目前在MDS的治疗中应用最为广泛的去甲基化药物（hypomethylating agent,HMA）,包括阿扎胞苷（Azacytidine,AZA）和地西他滨（decitabine,DAC）取得了一定的成绩,但其缓解率及疗效尚未令人满意,且易耐药、复发。近来免疫疗法,特别是免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors,ICI）在多种实体瘤中取得了重大进展,而程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）与程序性细胞死亡蛋白配体1（Programmed death-1 ligand,PD-L1）作为一对免疫共抑制分子成为研究热点[3]。目前已被FDA批准的抗PD-1单抗,包括Nivolumab单抗,pembrolizumab单抗等,不仅用于多种实体瘤,而且在霍奇金淋巴瘤的治疗中也已取得一定的成就[4]。令人鼓舞的是,PD-1/PD-L1在MDS中的作用也屡见报道,有望成为新的治疗靶点。然而,目前缺乏其在血液系统疾病尤其是MDS的大型临床研究。本研究通过应用流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）和实时荧光RT-PCR定量技术检测MDS患者HMA治疗前后外周血免疫细胞变化及PD-1/PD-L1、PD-1mRNA/PD-L1mRNA表达变化。探索MDS患者在应用HMA治疗过程中产生耐药的机制。方法:本实验标本来源于2019年10月至2021年03月河北医科大学第二医院血液内科住院患者,纳入中、高危MDS患46例（其中18例接受DAC方案治疗,28例接受AZA方案治疗）,正常对照组5例。MDS患者接受DAC 20mg/m~2/d×5d天或AZA 75mg/m~2/d×7d的化疗方案。采集入组患者治疗前及治疗后14天外周血、骨髓液。1)FCM检测HMA治疗前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞、Treg细胞、B细胞及NK细胞;2)FCM检测HMA治疗前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1和骨髓单个核细胞上PD-L1的表达变化;3)应用实时荧光RT-PCR定量技术检测HMA治疗前后外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMC）上PD-L1mRNA相对表达量变化。同时收集所有入组患者的详细临床相关资料。资料数据采用SPSS 22.0软件分析,P＜0.05差异有统计学意义。结果:1.FCM检测HMA治疗前后MDS患者外周血淋巴细胞比例的变化:1.1 HMA治疗前MDS患者外周血淋巴细胞比例变化（表1/图2）MDS患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（27.54±7.61）%、CD4+/CD8+比值为（0.89±0.48）,低于正常对照组（P=0.02、0.01）;CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（34.13±6.83）%、Treg细胞比例为（9.63±2.74）%,高于正常对照组（P=0.02、0.01）。外周血B淋巴细胞、NK细胞比例,与正常对照组比无差别（P＞0.05）。1.2 HMA治疗后MDS患者外周血淋巴细胞比例变化（表2/图2）MDS患者HMA治疗后外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（40.01±12.62）%、CD4+/CD8+比值为（1.88±1.34）,与治疗前比显著升高（P=0.00）;CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（25.76±7.46）%、Treg细胞比例为（5.21±2.69）%,治疗前比显著降低（P=0.00）。外周血B淋巴细胞、NK细胞比例,与治疗前比无差别（P＞0.05）。2.FCM检测HMA治疗前后MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达变化:2.1 HMA治疗前MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达（表3/图3）MDS患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（10.53±5.27）%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（11.45±4.95）%,与正常对照组比均显著升高（P=0.01、0.01）。2.2 HMA治疗后MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达（表4/图3）MDS患者HMA治疗后外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（15.61±5.63）%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（16.33±6.28）%,高于对照组及治疗前（P=0.00）。3.FCM检测HMA治疗前后MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达变化:3.1 HMA治疗前MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达（表3/图3）MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（7.45±2.98）%,与正常对照组比无差别（P＞0.05）。3.2 HMA治疗后MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达（表4/图3）MDS患者HMA治疗后骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（16.48±6.64）%,显著高于对照组及治疗前（P=0.00）。4.RT-PCR检测HMA治疗前后MDS患者外周血及骨髓单个核细胞上PD-1mRNA/PD-L1mRNA表达变化4.1 HMA治疗前MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达（表5）MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量为（2.80±1.94）,高于正常对照组（P=0.04）;骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达,与正常对照组相比无差别（P＞0.05）。4.2.HMA治疗后MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达（表5/图4）MDS患者HMA治疗后外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量为（10.60±5.89）,骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达表达量为（6.5±4.36）,显著高于正常对照组及治疗前（P=0.00）。5.HMA治疗后MDS患者淋巴细胞比例变化与预后关系,PD1/PD-L1表达变化对HMA疗效的影响5.1 HMA对淋巴细胞比例的变化和预后关系（表6/图6）有效组/无效组:HMA治疗后MDS患者无效组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（30.53±6.86）%、CD4+/CD8+比值为（0.98±0.31）,均显著低于有效组（P=0.01、0.00）;而CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（31.17±4.82）%、Treg细胞比例为（4.03±2.27）%,均显著高于有效组（P=0.04、0.03）。B淋巴细胞、NK细胞比例,与有效组比无差异（P＞0.05）。5.2 FCM检测PD-1/PD-L1表达变化和HMA疗效的关系（表7、8/图7、8）有效组/无效组:MDS患者HMA治疗后无效组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1表达值为（20.13±4.25）%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1表达值为（19.59±6.49）%、骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（19.91±4.88）%,均高于有效组（P=0.01）,并且随着疗效的降低PD-1/PD-L1表达绝对值逐渐升高。5.3 RT-PCR检测骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达变化和HMA疗效的关系（表9、10/图9、10）有效组/无效组:MDS患者HMA治疗后无效组骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达表达量为（8.97±2.58）,显著高于有效组（P=0.00）,随着疗效的降低PD-L1mRNA相对表达量绝对值逐渐升高。结论:1.MDS患者外周血T淋巴细胞亚群失调,CD4+辅助T淋巴细胞减少,而CD8+细胞毒性T淋巴细胞与Treg细胞数升高,CD4+/CD8+比例倒置,B细胞及NK细胞无明显差异,提示MDS患者存在免疫功能紊乱。经HMA治疗后免疫细胞部分恢复,以辅助性T淋巴细胞恢复为主,而Treg细胞比例降低,这可能与肿瘤免疫逃逸机制相关。2.MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达升高,而骨髓单个核细胞PD-L1表达与正常人无差别,经HMA治疗后PD-1/PD-L1表达均显著升高,并且随着疗效的降低,MDS患者PD-1/PD-L1平均表达绝对值升高,HMA治疗无效组PD-1/PD-L1表达显著高于有效组,提示PD-1/PD-L1可能与HMA耐药机制密切相关。3.MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量高于正常人,而骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA与正常人无差别,经HMA治疗后PD-1mRNA/PD-L1mRNA相对表达量均显著升高,同样随着疗效的降低,骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达绝对值升高,HMA治疗无效组PD-L1mRNA相对表达量显著高于有效组,进一步证明HMA治疗后PD-1/PD-L1升高,可能介导HMA耐药反应,提示预后不良。4.综上,HMA在MDS的治疗前后影响免疫细胞的比例发生变化,CD4+的辅助T细胞的比例上升,Treg的下调有助于对肿瘤细胞的清除,但是HMA又通过提高淋巴细胞上PD-1的表达,对T细胞功能发挥作用产生抑制作用,过度增高的PD-1表达会导致HMA的疗效欠佳,这可能是HMA发生耐药的机制之一。