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在失重或者模拟失重条件下,人体血液重新分布,动脉跨壁压在心水平以上(一般以心水平作为流体静压参考点)部位处于升高状态,而在心水平以下部位则出现动脉跨壁压降低现象,此外长期处于失重或微重力环境所致骨钙丢失、骨骼肌萎缩、免疫及内分泌系统改变所致血液内环境变化最终都会引起血管结构和功能的重塑。通过近年来的研究,我们实验室和国内外的多家实验机构都在真实或模拟的失重环境中证实了重力环境的改变可以导致血管产生区域特异性结构改变,在包括颈总动脉、脑基底动脉在内的前半身血管,会发生血管内径增大,同时伴有中膜增厚性变化,而后半身血管内径减小且血管中膜变薄。血管的结构重塑可能对航天员在轨和返回后的身体健康和工作能力造成不良影响,目前以补液和运动为主的措施防护作用有限,虽然进行了多年的探索,在失重或者模拟失重环境下动脉结构发生重塑的具体机制仍未得以研究完善。鞘脂是以鞘氨醇为基本结构单位的一系列脂类复合物,是真核细胞膜结构的重要组成部分,在细胞信号传递中亦发挥重要作用。神经酰胺(ceramide,Cer)生成和降解是鞘脂代谢的中心环节,Cer是内皮细胞及血管平滑肌细胞中最重要的脂质第二信使,其合成途径众多,其中酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)分解鞘磷脂产生Cer是调控细胞增殖、凋亡及炎性反应的重要通路,目前文献中多称之为ASM/Cer通路。血管平滑肌细胞的增殖、凋亡或细胞表型变化均为血管结构重塑的重要参与因素,多种内外环境因素均可对其造成改变,而ASM/Cer广泛参与细胞增殖、凋亡或细胞表型的调控,进而介导血管结构改变,但ASM/Cer在模拟失重大鼠动脉区域特异性结构重塑中的作用尚不清楚。基于以上前期大量的研究基础,提出下列问题:1.ASM/Cer于模拟失重条件下在大鼠各动脉中发生了怎样的变化?2.ASM/Cer在模拟失重大鼠动脉结构重塑中发挥了怎样的作用?其下游机制为何?为回答以上问题,我们针对颈总动脉(common carotid artery,CA)、基底动脉(basilar artery,BA)、肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)和股动脉(femoral artery,FA)展开了如下工作:1)观察模拟失重大鼠动脉血管形态学变化。采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察CA、BA、MA和FA的形态学变化。采用免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹技术、DNA断裂的原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)等方法检测模拟失重后大鼠动脉平滑肌细胞增殖和凋亡或细胞表型的变化。2)观察模拟失重后各动脉ASM/Cer水平是否发生变化。通过免疫组织化学染色及免疫蛋白印迹技术检测动脉中ASM蛋白表达、Cer含量和分布。3)观察ASM/Cer含量改变对各血管平滑肌增殖、凋亡水平或细胞表型的影响。通过HE染色、免疫组织化学染色、免疫蛋白印迹技术、TUNEL等方法检测ASM/Cer含量改变后大鼠动脉形态、平滑肌细胞增殖和凋亡水平或细胞表型的变化。并在培养平滑肌细胞中进行验证,初步检测组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)与ASM/Cer通路的联系。本工作的主要研究结果如下:1)模拟失重大鼠动脉结构变化。模拟失重后,大鼠CA和BA发生中膜肥厚,血管平滑肌增殖水平升高且凋亡水平降低;MA发生中膜萎缩,血管平滑肌增殖水平下降且凋亡水平升高;FA中膜平滑肌发生表型转化(由收缩表型转变为合成表型),血管平滑肌增殖及凋亡水平均升高。2)模拟失重大鼠动脉中ASM/Cer含量变化。ASM/Cer通路在前身动脉表达下调而在后身动脉表达上调。3)ASM/Cer改变在模拟失重所致大鼠动脉结构重塑中发挥的作用。改变动脉ASM/Cer水平后,观察血管平滑肌增殖、凋亡和细胞表型的变化:(1)CA&BA:(1)离体血管孵育:悬吊(hindlimb-unloaded tail-suspended,HU)大鼠CA和BA离体血管环孵育C6-神经酰胺(C6-Ceramide,C6-Cer)恢复血管中的ASM/Cer含量后血管平滑肌凋亡水平升高而增殖水平下降;对照(control,CON)大鼠CA和BA离体血管环孵育ASM抑制剂地昔帕明(desipramine,Dpm)后血管平滑肌凋亡水平降低而增殖水平升高。(2)在体给药:给CON大鼠服用ASM抑制剂多塞平(doxepin,DOX)以模拟失重后BA中ASM/Cer含量降低状态后,血管平滑肌凋亡水平降低而增殖水平升高。(2)MA:(1)离体血管孵育:HU大鼠MA离体血管环孵育Dpm降低血管中的ASM/Cer含量后,血管平滑肌凋亡水平下降而增殖水平升高。(2)在体给药:给HU大鼠服用DOX降低ASM/Cer含量降低后,血管平滑肌凋亡水平下降而增殖水平升高。(3)FA:(1)离体血管孵育:HU大鼠FA离体血管环孵育Dpm降低血管中的ASM/Cer含量后,血管平滑肌凋亡水平降低而增殖水平稍升高,且合成表型标记物/收缩表型标记物比值降低。(2)在体给药:给HU大鼠服用DOX降低ASM/Cer含量降低后,血管平滑肌凋亡水平降低而增殖水平升高,且合成表型标记物/收缩表型标记物比值降低。(4)培养血管平滑肌细胞:(1)C6-Cer孵育可使血管平滑肌细胞凋亡水平升高而增殖水平下降,合成表型标记物/收缩表型标记物比值升高,且上调CTSD表达量及活性,促使CTSD从溶酶体中释放至胞浆及胞核中,CTSD特异性抑制剂则可阻断C6-Cer的上述效应。(2)肿瘤坏死因子α(tumor necrosis fator-α,TNF-α)促进ASM活性增加,可诱导血管平滑肌细胞凋亡,Dpm孵育可抑制TNF-α的促凋亡效应,且使细胞增殖水平升高,合成表型标记物/收缩表型标记物比值降低,且降低CTSD的表达量,抑制CTSD活性,且抑制其从溶酶体的释放。目前经过实验,初步结论总结如下:在模拟失重条件下,大鼠CA和BA中ASM/Cer水平显著降低,MA和FA中的ASM/Cer水平同时显著升高,ASM/Cer的改变可能通过调控CTSD表达量、活性和细胞内分布进而介导血管平滑肌细胞增殖、凋亡或细胞表型改变,进而引起血管区域特异性结构重塑。