环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种细菌最常见的和重要的第二信使。它参与调节细菌生物膜的形成、运动、毒性、细胞周期、分化等过程。c-di-GMP信号通路控制细菌对非生物表面或与其他细菌和真核细胞的粘附能力,并在多种细菌的生活方式的改变中起着关键的作用。细胞中c-di-GMP的代谢由二鸟苷环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)催化,其中DGC具有GGDEF结构域,催化c-di-GMP的合成,PDE具有EAL结构域或HD-GYP结构域,催化c-di-GMP的降解。在实验室前期研究中,我们发现在蜡样芽孢杆菌0-9中存在一种c-di-GMP结合蛋白Dgc3,该蛋白编码基因缺失后,突变体的生物膜形成提高,运动能力下降。为了研究Dgc3在蜡样芽孢杆菌中的作用,我们利用蛋白质组学方法分析0-9野生型和dgc3基因突变体细胞内蛋白表达差异,发现112个蛋白表达量不同。为了分析c-di-GMP结合蛋白Dgc3的生理功能,本实验对7个差异表达蛋白的编码基因进行研究。通过生物信息学方法分析7个差异表达蛋白测定出的部分氨基酸序列,鉴定出7个差异表达蛋白。它们分别是热休克蛋白(Heat shock protein)DnaK,精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase)AdI、α-酮戊二酸脱氢酶 α 亚基(2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha)OgdH1、乙酰乙酰辅酶 A 还原酶(Acetoacetyl-CoA reductase)PhaB、金属蛋白酶(Metalloprotease)InhA1、金属蛋白酶InhA2和一个推定的保守蛋白(Conserved hypothetical protein)SmD。通过PCR分别扩增出上述7个蛋白编码基因开放阅读框的侧翼序列,连接含有热敏感复制子的穿梭载体pMAD,构建出7个基因敲除载体。在此基础上,将敲除载体转入蜡样芽孢杆菌0-9,经过红霉素抗性筛选、同源基因双交换和DNA测序等步骤,获得7个单基因缺失突变体。分别测定基因缺失突变体在运动性、生物膜形成、芽孢形成、胞外蛋白酶产生、耐热性、溶血性和胞外多糖产生等表型,发现与野生型0-9相比,热休克蛋白基因dnaK缺失突变体的蛋白酶产生增加,运动性、热敏感性、胞外多糖产生以及溶血性下降。表明热休克蛋白多效影响蜡样芽孢杆菌的生理活性和对环境的适应性。其它6个突变体中,除了编码推定的保守蛋白基因缺失菌株运动性下降之外,在测定条件下没有发现与野生型存在明显的变化。热休克蛋白DnaK在多种细菌中保守存在,通过分子伴侣的作用保持细菌内环境的稳定。为了分析蜡样芽孢杆菌中DnaK的作用,利用荧光定量PCR测定0-9菌株中dnaK基因在高温条件下的表达,发现经过热处理后,dnaK的表达量增加。分别来自枯草芽孢杆菌168的dnaK编码序列构建基因互补载体和互补菌株,测定野生型、dnaK突变体及其互补菌株的生理表型,结果显示dnaK突变体的运动性缺陷表型能够部分恢复。