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目的:帕金森病(Parkinson’S disease PD)是一种较为常见的椎体外系变性性疾病,由于其确切的发病机制迄今尚不十分明确,仍没有根治的办法。临床上多选用药物治疗延缓病情恶化,但由于长期用药导致疗效降低、毒副作用不耐受等,使患者不得不减少剂量或终止药物治疗。因此,寻找治疗效果好、安全性高的PD药物是当前的研究热点。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是从中药川芎中提取的有效成分,其被广泛应用于治疗神经和心血管性疾病。近年来,一些研究已经表明,川芎嗪在体内外具有神经保护作用。川芎嗪也被发现具有缺血性脑损伤的保护作用,并可促进细胞增殖与分化。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒素,对参与PD发生的神经元具有靶向作用。因此,MPTP已被广泛应用于帕金森病动物模型的建立。本实验的目的是探讨川芎嗪对MPTP所致大鼠中脑多巴胺神经元损伤的保护作用及可能的抗凋亡抗氧化机制,为帕金森氏病的临床治疗提供分子基础。方法:1.动物分组与模型处理大鼠随机分为4组,每组10只,分别为:对照组(Con,生理盐水注射),MPTP组(MPTP与生理盐水混合注射),TMP组(TMP注射),TMP+MPTP组(TMP与MPTP混合注射)。TMP(TMP 20mg/kg/d,TMP溶解于3%DMSO中,腹腔注射)给药7天。在第7天,大鼠黑质(SN)注入MPTP(1μmol MPTP溶解于2μl生理盐水中,参照坐标:AP:-5.0 mm,ML:±2.1 mm,DV:-7.7 mm,使用30量规针头从大鼠前卤,中线和头骨表面以0.35μl/min的速度注入),随后继续TMP给药7天。步行阶梯实验在第14天的14:00-18:00经行。实验后,将大鼠处死并解剖,取出纹状体和黑质以备后续实验。2.步行阶梯实验步行阶梯实验用于评价大鼠前后肢体的协调能力。在测试前大鼠被训练3天进行横跨梯子的训练,记录第14天进行的3次测试的平均成绩。3.多巴胺及其代谢产物的测定大鼠脱颈髓处死,冰台上迅速断头将纹状体取出,称重,于-80℃储存。检测时加入含有DHBA内标的0.1mol/L的高氯酸溶液0.5ml,匀浆,于4℃低温离心,15000r/min,离心l0min,取上清50μl用于高效液相色谱电化学检测。4.TBARS和GSH的测定参照说明书方法测定巴比土酸活性物质(TBARS)和谷胱甘肽(GSH)含量5.免疫组化染色将处理后的大鼠脑组织-20℃冷冻并连续切片(5um),置于玻璃载玻片上,在4oC下细胞与特异性抗体共同孵育过夜,与Cy3抗体共同培养。然后置于共聚焦显微镜下观察拍照。6.免疫组化检测酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数造模一周后大鼠断头处死,在冰上取中脑腹侧,立即将其置于4%多聚甲醛中固定,蔗糖脱水后进行冰冻切片,以15μm厚度连续切片,晾片后加大鼠抗TH单克隆一抗(1:1000),37℃下孵育l小时,PBS洗3次每次5分钟,加入荧光标记的兔抗大鼠二抗,37℃孵育60分钟,PBS洗3次,每次5分钟经封皮后荧光显微镜镜下观察黑质致密部(SNc)的TH阳性细胞数,图像分析系统计数,每组取5个动物,每个动物取5张切片,计算平均数值。7.Western Blot实验检测相关蛋白表达水平结果:1.川芎嗪对MPTP诱导的运动障碍的影响与Con组大鼠相比,MPTP组大鼠明显花费更多时间通过阶梯,证实MPTP诱导大鼠产生运动障碍;与MPTP组相比,TMP+MPTP组大鼠通过阶梯时间明显缩短,结果表明,TMP的干预,使MPTP诱导的大鼠运动障碍得到改善。2.川芎嗪对MPTP诱导的DA能神经元损伤的影响与Con组相比,MPTP组大鼠酪氨酸羟化酶免疫反应明显减少,DA和DOPAC水平明显降低;应用TMP干预后,抑制了DA和DOPAC水平的降低,可显著防止MPTP诱导的DA能神经元损伤。3.TMP对MPTP诱导的细胞凋亡的影响为了评估细胞凋亡的相关改变,我们检测Bax和Bcl-2的蛋白表达。在黑质中,MPTP组大鼠Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。而MPTP诱导的Bax和Bcl-2的蛋白表达改变能被TMP有效抑制。另外,我们检测了细胞质中细胞色素c的释放,与Con组相比,MPTP组细胞色素c释放增多,而TMP干预后细胞色素c的释放得到有效抑制。我们同时也检测了capase3的剪切,MPTP可促进capase3发生剪切,而TMP可显著降低capase3的剪切。这些结果说明TMP可抑制MPTP诱导的大鼠大脑黑质细胞凋亡。4.TMP对MPTP诱导的诱导的氧化应激的影响我们检测了TMP和MPTP对大鼠大脑黑质氧化还原平衡的影响。与Con组相比,MPTP组TBARS水平显著增加;说明MPTP引起了氧化损伤的发生。而TMP干预后可有效抑制TBARS水平的增高。MPTP组与Con组相比,GSH含量显著降低。而TMP干预后可以有效抑制其降低。与Con组相比,MPTP组Nrf2和GCLc表达明显降低降低。而TMP干预后能有效抑制Nrf2和GCLc的表达降低。这些结果说明TMP可抑制MPTP诱导的大鼠大脑黑质氧化应激损伤。结论:1.川芎嗪可以改善MPTP诱导的大鼠运动障碍并可显著防止MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤。2.川芎嗪的抗凋亡,抗氧化作用是其产生保护神经元损伤作用的可能机制。3.川芎嗪的抗凋亡作用是通过其抑制Bax表达,增加Bcl-2表达,抑制细胞色素c的释放,抑制caspase3的裂解来实现的;其抗氧化作用与调节Nrf2和GCLc有关。