水稻矮杆小粒基因OsDSG1的克隆和功能分析

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种子大小是影响作物产量的重要因素,调控种子大小的分子机制不仅是发育生物学上重要研究课题,也对农业生产具有重要的指导意义。水稻是世界上重要的粮食作物之一,同时又是研究单子叶植物的模式植物,所以对水稻产量的机制研究具有重要的理论意义和应用价值。近年来对水稻种子大小的研究取得了一定的进展,然而其分子调控机制还未完全解析,仍需进一步探索。  本论文以水稻矮杆小粒突变体dwarf and small grain1(dsg1)为研究材料,通过基因克隆和功能研究来阐述OsDSG1调控株高和种子大小的分子机制及其参与的信号调控网络,为提高水稻产量奠定理论基础。研究结果如下:  1.同野生型相比,dsg1突变体在营养生长时期表现为植株矮小、叶片直立;进入生殖生长时期后表现为种子变小、育性下降、株高降低及叶片直立等表型。分析野生型和突变体各个节间的长度变化发现,dsg1突变体属于各个节间均匀变短的dn类型矮杆突变体。统计并比较野生型和突变体的种子的粒长、粒宽以及千粒重,发现突变体种子的各项参数相较于野生型均明显变小。这些结果表明DSG1影响了株高以及种子大小。随后油菜素内酯(BR)敏感性实验表明抛1对外施BR不敏感,说明DSG1影响了BR信号转导。  2.通过图位克隆的方法,我们获得了DSG1基因,并发现dsg1突变体是由于DSG1基因最后一个外显子单碱基缺失造成的。构建自身启动子驱动的全长基因组DNA互补载体并转化dsg1突变体愈伤,转基因阳性植株能够恢复至野生型表型。DSG1编码一个丝裂原活化蛋白激酶,同源性分析结果表明DSG1与拟南芥AtMAPK6具有84.5%的序列相似性,所以命名为OsMAPK6,OsMAPK6具有典型的T-E-Y磷酸化位点,属于A类MAPK。  3.基因表达分析结果表明:MAPK6在各个器官中均有表达,在小穗以及颖壳中的表达量相对较高,这与MAPK6在种子发育过程中所行使的功能是一致的。亚细胞定位分析结果表明:OsMAPK6定位在细胞质和细胞核中。  4.细胞组织学观察表明突变体种子变小,株高变矮等表型是由于细胞数目变化引起,说明OsMAPK6影响了细胞分裂过程,检测细胞周期相关基因在野生型和突变体中的表达情况发现,正向调控因子CYCD4;1在突变体中的表达量下降,暗示OsMAPK6通过调控CYCD4;1的表达量而影响细胞分裂,从而导致其突变后造成突变体表型。  5.实时定量分析BR相关基因在野生型和突变体中的表达量发现,OsBAK1、OsMD P1以及OsLIC在突变体中表达量下降,而OsILI1在突变体中表达量上升,表明OsMAPK6影响了BR信号通路基因的表达。同时检测受反馈调节的BR合成基因的表达情况发现,BR处理后dsg1中这类基因受抑制情况或消失或减少,说明OsMAPK6对BR负反馈调节相关基因是必需的。  6.酵母双杂交以及Pull-down实验表明OsMAPK6可以与OsMKK4互作,提示OsMKK4-OsMAPK6参与了水稻种子大小调控。  7.磷酸化蛋白质组分析和酵母文库筛选发现了OsMAPK6潜在靶蛋白,但需要进一步验证。  我们的研究结果表明DSG1/OsMAPK6可以与OsMKK4互作,通过影响细胞分裂以及油菜素内酯信号转导参与调控了水稻株型和粒型。这对于阐明水稻株高和粒型的分子机制以及指导水稻育种具有重要价值。
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