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目的：通过研究幽门螺杆菌(Helicobactor pylori，Hp)尿素酶B亚单位(UreB)刺激胃上皮(AGS)细胞凋亡对巨噬细胞功能的影响，探索机体针对Hp感染的免疫应答机制。
方法：体外构建pET-32a-UreB载体，将质粒转染到BL21菌株内，IPTG诱导其UreB蛋白表达，通过NI柱对蛋白进行纯化后，采用SDS-PAGE技术和蛋白印迹法进行鉴定，最后利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测该蛋白浓度。将纯化的UreB蛋白按照不同浓度加入胃上皮(AGS)细胞中，采用流式细胞术观察细胞的凋亡情况。体外培养人单核巨噬细胞(THP1)，经100ng/mL佛波酯诱导贴壁后，再用LPS诱导其M1型极化。收集经UreB刺激AGS细胞的培养上清和对照组上清，并与巨噬细胞共培养。采用流式细胞术检测巨噬细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-ɑ的水平，蛋白印迹法检测巨噬细胞M1型标志物一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg1)蛋白表达水平。荧光定量PCR(RT-qPCR)检测巨噬细胞M1和M2亚型的分子标志物CD86、CD163基因mRNA水平，判断巨噬细胞极化的方向。使用琼脂平板计数法检测巨噬细胞的吞噬杀伤能力，免疫荧光法检测吞噬体和溶酶体共定位水平。采用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用对两组AGS细胞上清中含有的代谢物进行差异分析，并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其中两个差异表达的代谢物AMP和GMP进行验证。将外源性添加AMP、GMP的AGS细胞培养上清分别加入巨噬细胞，采用流式细胞术和蛋白印迹法检测巨噬细胞的极化标志物，琼脂平板计数法和免疫荧光法检测巨噬细胞的吞噬杀伤能力。
结果：(1)成功构建pET-32a-UreB载体,重组质粒转染大肠杆菌菌株BL21后诱导82kDa的融合蛋白的表达，用Ni-NTA柱纯化获得高纯度的目的蛋白，并通过SDS-PAGE电泳和蛋白印迹法鉴定为UreB蛋白。(2)流式细胞检测结果显示，5~40μg/mLUreB蛋白处理胃上皮(AGS)细胞24h后，细胞的凋亡率明显增高，且随着UreB蛋白浓度的升高逐渐升高。(3)ELISA结果显示，将UreB诱导AGS细胞凋亡后的培养上清加入到THP-1来源M1型巨噬细胞共培养后，与PBS处理AGS细胞的培养上清对照组相比，TNF-α和IL-6分泌显著降低，而IL-10分泌显著升高。通过对巨噬细胞极化标志物检测发现，实验组巨噬细胞M1亚型标记物CD86、iNOS表达水平相比于对照组显著下降，M2型标记物CD163和Arg1表达水平上升。琼脂平板计数法的结果显示，与对照组相比，巨噬细胞的吞噬杀伤能力降低。免疫荧光结果显示，巨噬细胞内吞噬体和溶酶体共定位水平降低。(4)火山图分析显示，在AGS细胞上清中质谱分析共计检测到453种代谢产物，相比于PBS对照组，UreB刺激组有40种表达上调，16种表达下调。用ELISA验证其中的AMP及GMP，发现UreB刺激组AMP和GMP分泌水平升高。外源AMP添加组的巨噬细胞向M2型极化，即M1亚型标记物CD86、iNOS表达水平下降，M2型标记物CD163和Arg1表达水平上升，TNF-α和IL-6显著降低，而IL-10分泌升高；同时巨噬细胞的吞噬杀伤能力和吞噬溶酶体共定位水平降低。而外源GMP添加组和对照组相比，巨噬细胞未发现有明显差异。
结论：(1)成功构建pET-32a-UreB载体，制备出高纯度的UreB重组蛋白，UreB蛋白以剂量依赖的方式诱导AGS细胞凋亡。(2)UreB处理AGS细胞凋亡后的培养上清对巨噬细胞存在免疫抑制的效应，可通过释放AMP来发挥免疫抑制作用。
方法：体外构建pET-32a-UreB载体，将质粒转染到BL21菌株内，IPTG诱导其UreB蛋白表达，通过NI柱对蛋白进行纯化后，采用SDS-PAGE技术和蛋白印迹法进行鉴定，最后利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测该蛋白浓度。将纯化的UreB蛋白按照不同浓度加入胃上皮(AGS)细胞中，采用流式细胞术观察细胞的凋亡情况。体外培养人单核巨噬细胞(THP1)，经100ng/mL佛波酯诱导贴壁后，再用LPS诱导其M1型极化。收集经UreB刺激AGS细胞的培养上清和对照组上清，并与巨噬细胞共培养。采用流式细胞术检测巨噬细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-ɑ的水平，蛋白印迹法检测巨噬细胞M1型标志物一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg1)蛋白表达水平。荧光定量PCR(RT-qPCR)检测巨噬细胞M1和M2亚型的分子标志物CD86、CD163基因mRNA水平，判断巨噬细胞极化的方向。使用琼脂平板计数法检测巨噬细胞的吞噬杀伤能力，免疫荧光法检测吞噬体和溶酶体共定位水平。采用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用对两组AGS细胞上清中含有的代谢物进行差异分析，并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其中两个差异表达的代谢物AMP和GMP进行验证。将外源性添加AMP、GMP的AGS细胞培养上清分别加入巨噬细胞，采用流式细胞术和蛋白印迹法检测巨噬细胞的极化标志物，琼脂平板计数法和免疫荧光法检测巨噬细胞的吞噬杀伤能力。
结果：(1)成功构建pET-32a-UreB载体,重组质粒转染大肠杆菌菌株BL21后诱导82kDa的融合蛋白的表达，用Ni-NTA柱纯化获得高纯度的目的蛋白，并通过SDS-PAGE电泳和蛋白印迹法鉴定为UreB蛋白。(2)流式细胞检测结果显示，5~40μg/mLUreB蛋白处理胃上皮(AGS)细胞24h后，细胞的凋亡率明显增高，且随着UreB蛋白浓度的升高逐渐升高。(3)ELISA结果显示，将UreB诱导AGS细胞凋亡后的培养上清加入到THP-1来源M1型巨噬细胞共培养后，与PBS处理AGS细胞的培养上清对照组相比，TNF-α和IL-6分泌显著降低，而IL-10分泌显著升高。通过对巨噬细胞极化标志物检测发现，实验组巨噬细胞M1亚型标记物CD86、iNOS表达水平相比于对照组显著下降，M2型标记物CD163和Arg1表达水平上升。琼脂平板计数法的结果显示，与对照组相比，巨噬细胞的吞噬杀伤能力降低。免疫荧光结果显示，巨噬细胞内吞噬体和溶酶体共定位水平降低。(4)火山图分析显示，在AGS细胞上清中质谱分析共计检测到453种代谢产物，相比于PBS对照组，UreB刺激组有40种表达上调，16种表达下调。用ELISA验证其中的AMP及GMP，发现UreB刺激组AMP和GMP分泌水平升高。外源AMP添加组的巨噬细胞向M2型极化，即M1亚型标记物CD86、iNOS表达水平下降，M2型标记物CD163和Arg1表达水平上升，TNF-α和IL-6显著降低，而IL-10分泌升高；同时巨噬细胞的吞噬杀伤能力和吞噬溶酶体共定位水平降低。而外源GMP添加组和对照组相比，巨噬细胞未发现有明显差异。
结论：(1)成功构建pET-32a-UreB载体，制备出高纯度的UreB重组蛋白，UreB蛋白以剂量依赖的方式诱导AGS细胞凋亡。(2)UreB处理AGS细胞凋亡后的培养上清对巨噬细胞存在免疫抑制的效应，可通过释放AMP来发挥免疫抑制作用。