论文部分内容阅读
目的:研究构建模拟角膜基质创伤修复过程中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-α)空间动态分布的体外三维培养系统。方法:从新鲜牛眼中分离角膜基质细胞,用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基进行培养,而后构建Pellet体外三维培养模型进行培养。将Pellet分为有透析袋组和无透析袋组,置入Transwell小室系统上下室中培养48h后换液,上室为0.5 μg.L-1TGF-[β1+0.25μg·L-1TGF-α2+体积分数10%FBS,下室为体积分数10%FBS,分别于培养后72h观察Pellet培养模型的形态变化并采用Real-time PCR法分别检测2组上下室Pellet中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ 型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)和 Col Ⅲ mRNA 相对表达量。结果:培养后72h Pellet均成团状生长。有透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为 1.595±0.025、1.148±0.009,FN mRNA表达量分别为1.090±0.011、0.844±0.015,Col Ⅰ mRNA表达量分别为1.445±0.035、1.165±0.008,Col Ⅲ mRNA 表达量分别为 1.726±0.031、1.314±0.020,Col Ⅲ/Col Ⅰ比值分别为 1.126±0.019、0.957±0.013,上下室各项指标比较差异均有统计学意义(均为P=0.000)。无透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为1.363±0.018、1.360±0.002,FN mRNA 表达量分别为 0.946±0.017、0.952±0.012,Col Ⅰ mRNA 表达量分别为 1.261±0.011、1.258±0.029,Co1 Ⅲ mRNA 表达量分别为 1.459±0.027、1.462±0.033,Col Ⅲ/ColⅠ比值分别为 1.157±0.029、1.163±0.090,上下室各项指标比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。无透析袋组上室细胞中α-SMA、FN、ColⅠ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。无透析袋组下室细胞中α-SMA、FN、ColⅠ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论:Transwell小室系统与透析袋相结合可构建模拟TGF-β空间动态分布的体外三维培养系统。背景:转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-α参与并介导了角膜损伤修复的过程,诱导角膜基质细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)纤维化,引起病理性ECM沉积,导致瘢痕形成。现有体外创伤修复研究一般基于二维培养,实际上TGF-β在角膜损伤修复有空间和时间的动态变化,TGF-β1和TGF-β2在损伤区表达量随时间变化,TGF-β1可在损伤中期扩散至未损伤区,促进周边未损伤区向损伤区增殖迁移,促进创面愈合。然而,目前对于损伤区与非损伤区细胞及因子间相关性的分析鲜有报道。我们在前期研究工作中建立了体外角膜基质细胞ECM纤维化模型,本研究拟改良三维培养系统以便于研究生长因子的时空变化对角膜创伤修复的影响。目的:构建模拟角膜基质创伤修复过程中TGF-β时空动态分布的体外三维培养系统。方法:从新鲜牛眼中分离角膜基质细胞,构建Pellet体外三维培养模型进行培养。将Pellet分为三组,分别置入15ml离心管、小室包裹有透析袋的Transwell小室系统上下室中分别为基础培养液组(命名为空白组)、上室模拟伤口区TGF-β时空分布组(命名为上室组)、下室模拟伤口外区TGF-β时空分布组(命名为下室组)。空白组持续以基础培养液培养21d。Transwell小室中 Pellet 培养 48h 后换液,上室为 0.5μg-L-1 TGF-β1+0.25μg-L-1 TGF-β2+基础培养液,下室为基础培养液;培养72h后换液,上室为0.5μg-L-1TGF-β1+0.5μg·L-1 TGF-β2+基础培养液,下室为基础培养液;培养5d后换液,上室为0.5μg·L-1 TGF-β1+1.0μg·L-1 TGF-β2+基础培养液,下室为基础培养液;培养7d后换液,上室为0.5μg·L-1 TGF-β1+0.5μg·L-1 TGF-β2+基础培养液,下室为0.5μg·L-1 TGF-β1+基础培养液;培养9d-14d时改换换液方案,上室为0.25μg·L-1 TGF-β2+基础培养液,下室为0.25μg·L-1 TGF-β1+基础培养液;培养14d-21d时改换换液方案,上下室为基础培养液。分别于培养后48h、72h、5d、7d、14d、21d观察Pellet培养模型的形态变化,钙黄绿素-AM/碘化丙啶(Calcein-AM/propidium,Calcein-AM/PI)法检测各组Pellet活性,Real-time PCR法分别检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ 型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ 型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)、角膜蛋白(Keratocan,KERA)、基膜聚糖(Lumican,LUM)mRNA 相对表达量。分别于培养后48h、7d、14d应用免疫荧光化学法(Immunofluorescence,IF)检测各组Pellet α-SMA、FN、ColⅠ、Col Ⅲ蛋白的表达与定位。于培养21d时应用透射电子显微镜观测各组Pellet胶原纤维直径大小及空间排列。结果:置入Transwell小室培养后Pellet仍可成团生长,可长期培养。Calcein-AM/PI染色法结果显示三组Pellet死亡细胞随培养时间的延长而增多,但仍有大量活细胞。Real-time PCR结果显示Pellet培养72h、5d、7d后上室组纤维化标志物α-SMA、FN、Col Ⅲ mRNA表达量及Col Ⅲ/Col Ⅰ比值高于下室组与空白组,而下室组与空白组之间无显著差异;培养14d及21d后上室组α-SMA、FN、Col Ⅲ mRNA表达量及Col Ⅲ/ColⅠ比值高于下室组与空白组(均P<0.05);培养48h、72h、5d、7d、14d及21d后三组Pellet均有LUM和KERA mRNA表达;14d、21d时,空白组LUM和KERA mRNA显著高于上室组和下室组(均P<0.05)。IF结果显示Pellet培养48h、7d、14d后均可检测到α-SMA、FN、ColⅠ、Col Ⅲ蛋白的表达,培养7d、14d时上室组Pellet模型中α、FN、Col Ⅲ蛋白的相对表达量均显著高于下室组、空白组,且上室组Col Ⅲ/Co1 Ⅰ的比值也明显高于下室组和空白组(均P<0.05);培养48h、7d时下室组与空白组之间各项指标无统计学差异。Pellet培养21d后,透射电子显微镜观测结果示空白组胶原纤维排列整齐,直径大小一致性好,上室组胶原纤维排列紊乱,直径跨度很大,均匀性差,下室组胶原纤维排列较整齐,直径均匀性也较上室组好,接近空白组。结论:添加了 TGF-β1及TGF-β2的Transwell上室可模拟角膜基质损伤时伤口区TGF-β的时空变化,上室Pellet发生ECM显著纤维化,其发生时间较单纯TGF-βl培养的Pellet早。添加了 TGF-β1的下室可模拟角膜基质损伤时非伤口区TGF-β的低表达,其Pellet发生轻度纤维化。与未添加TGF-α的空白对照组相比,上室与下室ECM纤维化均更显著。利用该三维培养系统联合上下室TGF-β的时间及空间动态控制,可作为模拟体内角膜基质损伤修复中伤口区及非伤口区的TGF-β的动态分布,可作为体外研究角膜基质损伤修复的三维培养候选模型。