目的:胶质瘤是最常见原发中枢神经系统肿瘤,占原发性脑肿瘤的40-50%。世界卫生组织（WHO）依据肿瘤细胞的恶性程度将胶质瘤分为I、II、III,IV级,其中以IV级胶质母细胞瘤（GBM）的恶性程度最高。目前对于GBM的主要治疗方式包括最大范围的手术切除,以及术后的辅助放疗及化疗。即便如此,GBM患者的中位生存期也仅有15个月。考虑到GBM高度的异质性,极强的侵袭能力以及对传统治疗方式的抵抗作用,揭示GBM内部的分子机制对理解肿瘤的发生、发展、明确诊断及改善治疗效果具有重要的意义。近年来基因芯片及测序技术的快速发展,为研究肿瘤中的分子表达特点提供了便利的手段。Verhaak等研究者通过对癌症基因组图谱（TCGA）中GBM样本的分子表达数据进行无监督聚类分析后发现,GBM依据其分子表达特点可进一步细分为四个亚型:经典亚型型、间质亚型,神经元型,前神经元型。其中间质亚型的GBM患者相比于其他亚型GBM患者的恶性程度更高,总生存期更短,并且在临床治疗过程中呈现出了极易复发和对放化疗治疗抵抗的特点。相反的,前神经元亚型的GBM患者相比于其他亚型GBM患者则体现出了最好的预后状态。另有研究发现,当前神经亚型和经典亚型的GBM复发时,复发的肿瘤往往具有间质表型特征,并且,放射治疗与化疗同样会诱导间质亚型的特征性分子标志物的表达水平的升高。这些研究均表明,其它亚型向间质亚型的转变与GBM的恶性进展存在密切联系。然而,关于间质亚型转变的的具体调控机制尚不明确。微小RNA是一类长约22个碱基的非编码RNA。成熟miRNA靶向结合信使RNA的3’非编码区,以转录后调控的方式抑制其翻译并促进其降解。大量的研究证明,肿瘤的发生发展过程中伴随着多种miRNA表达的失调。其中一些miRNA通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移进而促进肿瘤的恶性进展,而另一些miRNA则通过抑制促癌基因的表达起到抑制肿瘤发展的功能。最新的研究显示,miRNA在抑制GBM的间质转变过程中发挥着重要的作用,如miR-181d,miR-218。我们的课题组之前的研究发现,miRNA-504在胶质瘤中表达水平低于瘤周组织（NBT）,并且可以独立评估高级别胶质瘤患者的预后。另外,通过后续的细胞功能学实验证实,miR-504可以通过抑制FOXP1的表达发挥抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的作用。另有一项研究显示,在GBM中,miR-504的表达与间质的特征基因YKL-40,CD44,VIM的表达之间存在负相关性。这些结果提示,在GBM中,miR-504可能在调控间质表型转变的过程中发挥重要的作用。本次研究目的是揭示miR-504在调控GBM恶性间质表型中发挥的作用并探索其作用机制,为间质亚型GBM的临床诊断提供新的生物学标志物,并为胶质瘤的治疗提供新的分子靶点。研究方法:1、样本收集及数据下载:我们收集了2016年7月-2017年6月在中国医科大学附属第一医院神经外科手术切除的50例GBM组织和10例瘤周组织,所有肿瘤组织均通过术后病理证实为GBM。我们从TCGA数据库（http://cancergenome.nih.gov）下载3级水平的miRNA/mRNA的表达数据及对应的临床资料数据,同时具有miRNA表达数据和mRNA表达数据的517个GBM肿瘤样本和10个瘤周组织样本纳入本次研究。GSE90603从GEO数据库中下载。2、通过主成分分析方法研究miR-504的相关基因在间质亚型GBM与前神经元亚型GBM之间的分布模式。3、基于miR-504负相关性最高的200个基因以及在低表达miR-504 GBM组织中上调最显著的200个基因,利用DAVID在线分析软件（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO分析,预测miR-504参与的生物学过程。4、基因集富集分析（GSEA）（www.broadinstitute.org/gsea）,研究低表达mi-504组中显著富集的生物学过程。5、U87与U373细胞培养,胶质瘤干细胞的（GSCs）的分离、鉴定、培养及慢病毒的转染。胶质母瘤细胞瘤来源的细胞系U87、U373于含10%胎牛血清（FBS）的高糖培养基（DMEM）中培养。培养条件均为37。C,5%CO2。U87来源的胶质瘤干细胞（GSCs-U87）的筛选采用干细胞培养基条件培养下克隆成球的方法。原代肿瘤干细胞（GSCs-1295）提取于GBM组织,将分离的细胞转移至75cm2的细胞培养瓶中,加入干细胞培养基培养。直至肿瘤细胞球形成。细胞免疫荧光检测干细胞表面神经干细胞标志物CD133的表达及诱导分化后星型细胞标志物GFAP的表达。GSCs-U87与GSCs-1295细胞生长于含有B27细胞培养添加剂、上皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）的DMEM/F12培养基中,培养条件均为37。C,5%CO2。使用包含miR-504编码序列的慢病毒载体转染U87、U373、GSCs-U87、GSCs-1295细胞,空载体作为阴性对照。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达水平,评估转染效率,qRT-PCR验证miR-504表达水平使用包含FZD7编码序列的慢病毒载体转染之前构建的稳定表达miR-504的U87及U373细胞,qRT-PCR定量检测转染效率,western-blot检测FZD7蛋白表达水平。6、通过TRIZOL法从样本中提取总的RNA,使用相应的miRNA反转录试剂盒与mRNA试剂盒合成cDNA后,使用SYBR GREEN法检测miRNA,mRNA的表达丰度。U6作为miRNA检测时的内参,GAPDH作为mRNA检测时的内参。7、划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力的改变。8、Transwell侵袭实验检测肿瘤细胞侵袭能力的改变。9、细胞免疫荧光检测肿瘤细胞中目的蛋白的表达水平。9、蛋白免疫印迹用于检测蛋白表达水平的改变。10、干细胞成球实验检测胶质瘤干细胞自我更新能力。11、裸鼠皮下成瘤实验检测过表达miR-504后,肿瘤干细胞的致瘤能力的改变。12、免疫组化用于检测移植瘤组织中CD133,KLF4和FZD7蛋白的表达水平。13、双荧光素酶报告实验检测miR-504与FZD7的3’UTR的靶向结合。。结果:1、miR-504在GBM组织及细胞系中表达显著低于瘤周组织。2、miR-504在间质亚型的GBM中低表达,并且与间质亚型的特征基因之间具有显著的负相关性。3、生物信息学分析揭示miR-504参与多个间质表型相关的生物学过程的调控,如上皮向间质转化（EMT）,细胞粘附,血管形成。4、过表达miR-504抑制胶质母细胞的侵袭、迁移能力及EMT过程。5、过表达miR-504抑制胶质瘤干细胞自我更新能力,致瘤能力以及肿瘤干细胞标志物的表达。6、miR-504靶向结合卷曲蛋白-7（FZD7）的3’非编码区,抑制肿瘤细胞中FZD7转录水平和蛋白水平的表达。7、miR-504通过靶向调控FZD7介导的Wnt通路活性抑制肿瘤细胞的间质表型。划痕及Transwell侵袭实验结果提示过表达FZD7部分挽救了miR-504诱导的肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的减弱（P<0.05）。另外,过表达miR-504抑制了U87胞质中wnt通路核心分子β-catinen的入核,并且减少了β-catinen,p-GSK3β蛋白的表达,而重新过表达FZD7后,β-catinen,p-GSK3β表达重新升高。8、生存分析和COX多因素回归模型证实,低miR-504/FZD7比值分数（ratio）患者的总生存期更短,是评估GBM患者不良预后的独立因素。另外我们还发现,低miR-504/FZD7 ratio的患者表现出更明显的放疗和化疗抵抗作用。结论:1、miR-504通过靶向调控FZD7介导的Wnt/β-catenin通路活性,抑制胶质母细胞瘤的间质表型。2、低miR-504/FZD7 ratio提示GBM患者具有更短的总生存期,并可作为评估GBM患者预后的独立危险因素。同时,低miR-504/FZD7 ratio提示GBM患者对放疗及化疗敏感性更差。