论文部分内容阅读
本文以抗盐性很强又有重要利用价值的真盐生植物盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）为材料,利用转录组测序分析和非损伤微测技术,对高盐低氮条件下盐地碱蓬NO3--N吸收、转运的生理及分子机制进行初步探究。希望能为盐生植物氮素营养研究提供理论依据。结果如下:1.高盐低氮条件下盐地碱蓬幼苗的转录组测序结果分析及验证低氮条件下培养1个月的盐地碱蓬幼苗用高盐（由100 m M NaCl增至300m M NaCl）和低盐（0 m M NaCl）处理后进行转录组测序。测序结果显示:从样品c DNA文库中共获得41.63 Gb数据量,Q30（0.1%的错误率）达到85%;从头组装后共获得91957条Unigenes,其中长度在1 kb以上的Unigenes有25264条;进行基于Unigene库的基因结构分析,包括ORF预测、SSR分析以及样品间SNP分析,获得SSR标记10915个;进行Unigenes的生物信息学注释,包括与GO、COG、Swiss-Prot、NR、KEGG数据库的比对,共获得Unigenes的注释结果53186条。低氮条件下转录组测序中盐地碱蓬的对照组（0 m M NaCl）的根与处理组（300 m M NaCl）的根相比,得到8840个差异表达基因,其中上调基因为6686个,下调基因为2154个。一些与硝态氮高效吸收（NRT2.1、NRT3.1和一些与Plasma membrane（PM）H+-ATPase相关的基因）和转运（NRT1.5）相关的关键基因的表达量在盐度条件下都是上调的。因此,我们初步推测盐地碱蓬在高盐低氮条件下叶片能够积累较多的NO3-可能是由于这些关键基因的上调引起的。同时,选取了16个基因进行荧光定量PCR证明了转录组数据的可靠性,说明转录组测序的数据可以用来作深入研究。2.不同浓度NaCl对盐地碱蓬硝态氮吸收的影响低氮（0.5 m M NO3--N）水平上,不同NaCl处理时,随着盐浓度的升高盐地碱蓬中与硝态氮高效吸收（NRT2.1、NRT3.1和与PM H+-ATPase相关的基因）和转运（NRT1.5）相关的关键基因的表达量都是被盐分上调的,200 m M NaCl条件下其上调量尤其显著。同时,200 m M NaCl处理时其地上地下的干重都是增加的。200 m M NaCl显著增加盐地碱蓬根和木质部汁液中的NO3-含量而400 m M NaCl处理时却没有降低其根和木质部汁液中的NO3-的含量。另外,非损伤微测分析显示0和200 m M NaCl处理时盐地碱蓬根的NO3-流量趋势大体相似,400 m M NaCl处理时外排量更明显。以上结果表明200 m M NaCl能够促进盐地碱蓬NO3-自根向地上部的运输且没有显著抑制NO3-的吸收。上述结果证明了我们的推测,即高盐低氮条件下盐地碱蓬能够高效吸收和转运NO3-。这一特性可以部分解释为什么盐地碱蓬及其它真盐生植物不仅能够耐受较高的盐度并且在200-300 m M NaCl这个能使一般作物致死的盐度下具有最大的生物量。3.盐地碱蓬高亲和力NO3-转运蛋白的基因Ss NRT2.1的初步克隆以转录组测序所得的片段-盐地碱蓬高亲和力NO3-转运蛋白的基因NRT2.1（2346bp）设计引物,通过PCR的方法从200 m M NaCl处理的盐地碱蓬根中克隆NRT2.1的中间片段（暂时命名为Ss NRT2.1）。已获得三段序列,将其在NCBI上比对结果如下:片段一与菊花、无油樟、烟草和胡杨等的同源基因的相似度高达94%,说明该片段极有可能是我们的盐地碱蓬高亲和力NO3-转运蛋白的基因Ss NRT2.1的一段中间片段;片段二与短柄草、谷子、鹰嘴豆和木本棉等的同源基因的相似度高达96%,主要是一些预测的功能,并不是很确定,只能说明有可能是Ss NRT2.1的一段中间片段;片段三主要和一些物种的NRT2家族相关基因的相似度较高,例如,蓖麻、小立碗藓、麻风树、芝麻、胡杨、草莓和烟草,因此,该片段还需进一步研究。目前RACE技术被广泛用于基因全长的克隆,其操作简便,因此我们下一步将利用本试验获得的Ss NRT2.1的中间片段利用RACE技术以获得该基因的全长,进而确定该基因的功能。