论文部分内容阅读
沙门菌病是一种重要的人畜共患病,给动物和人类健康带来巨大的危害。沙门菌在养殖场中广泛存在,尤其禽养殖场;在禽上,沙门菌不仅能水平传播,而且通过卵垂直传播,严重影响养禽业的发展。沙门菌也是主要的食源性致病菌,人类因食用感染的禽蛋、禽肉制品等导致食物中毒,沙门菌在细菌性食物中毒中占首位。近年来,国内外主要采用抗菌药物防治禽沙门菌病,然而,由于抗菌药物的滥用,其耐药性逐年增强,耐药谱也越来越广,给沙门菌病的防控增加了难度,且对公共卫生造成安全隐患。因此,加强对沙门菌的监测,尤其是加强对耐药沙门菌的流行情况和耐药性研究有着非常重要的现实意义。本研究于2020年12月至2021年8月间,从四川攀枝花市、金堂县、新都区、龙泉驿区、什邡县、汶川县、彭山区7个地区采集禽源样本,泄殖腔棉拭子、死禽、死胚等943份,分离沙门菌,采用沙门菌A-F多价血清和单因子血清凝集试验,以及inv A基因PCR扩增鉴定分离菌;进一步开展沙门菌分离株的药物敏感性检测,结合采样地区养殖场抗生素使用情况,为临床上合理选用抗菌药物控制沙门菌感染提供依据;对优势血清型多重耐药菌株进行致病性及全基因组测序分析,为阐明其致病机制及耐药机制提供科学依据。主要结果如下:1.禽沙门菌的分离鉴定及耐药性（1）根据GB4789.4-2016方法,从943份禽源样本中共分离鉴定出100株沙门菌,总分离率为10.60%（100/943）。玻片凝集法血清型鉴定结果显示,100株沙门菌中95株已确定了血清型,分别属于7种血清型,其中,鼠伤寒沙门菌55株、鸡白痢沙门菌17株、肠炎沙门菌10株为优势血清型;哈托及波恩沙门菌分别为5株和4株,国内外首次从鸭源中分离到哈托沙门菌;里僧和切斯特沙门菌均为2株。以上研究结果丰富了沙门菌资源库,为开展相关研究提供了重要材料。（2）采用K-B法对沙门菌分离株耐药表型进行测定,结果显示,沙门菌分离株对磺胺异噁唑的耐药率最高达83.2%;其次为链霉素（80.4%）和多粘菌素B（75.7%）;对复方新诺明（58.9%）、萘啶酸（53.3%）、氨苄西林（50.5%）、四环素（44%）、多西环素（44.9%）及阿莫西林（41%）的耐药性较严重;对头孢唑林（15%）、头孢曲松（14.7%）、氯霉素（10.3%）和头孢噻肟（10.3%）的耐药率在10%～15%,耐药率较低;对环丙沙星（8.5%）、诺氟沙星（3%）耐药率均低于10%。多重耐药研究结果发现,100株禽沙门菌分离株的多重耐药率高达86%,其中1株鸭源分离菌株对本研究中检测的17种抗菌药物全部耐药,有必要进一步研究其耐药机制。根据采样的各个养殖场抗菌药物使用情况,结合该场沙门菌耐药率结果,可为养殖场合理选用抗菌药物提供参考。2.两株优势血清型多重耐药沙门菌分离株的致病性和全基因组测序分析（1）对2株优势血清型多重耐药沙门菌分离株S19和C46进行致病性试验,分别选取1.0×10~5～1.0×10~9 CFU共5个梯度的菌量测定其对昆明小鼠的LD50。结果显示,S19和C46株对昆明小鼠的LD50分别为6.30×10~6 CFU、1.58×10~6CFU,表明2株优势血清型多重耐药沙门菌具有一定的致病力。（2）采用Nanopore Prometh ION和Illumina Nova Seq PE150方法对S19和C46株测序,测序结果显示,S19和C46株基因组全长分别为4974488 bp、4974486bp,GC含量均为52.16%;2株沙门菌均有一个大质粒,质粒序列大小分别为186949 bp、165552 bp,GC含量分别为47%、46.54%;S19和C46株预测编码基因的数量分别为5007个和4984个,非编码基因个数均为108个。2株沙门菌基因组中基因岛均有14个,基因岛总长度均为344765 bp;前噬菌体均有12个,前噬菌体序列总长度分别为777348 bp、789041 bp。（3）基因预测结果发现S19和C46株毒力基因分别为573个和571个,其中结构性毒力基因最多,均有173个,说明2株沙门菌的侵袭力及对抵抗宿主的防御机制较强,其中菌毛相关的基因有34个,主要为Ⅰ型菌毛（fimA、fimC、fimF、fi I、fimD、fimH、fimW、fimY等）和Ⅳ型菌毛（pil L、pil W等）。其次是毒力岛上的毒力基因,2株沙门菌均有82个;主要为SPI-1（inv、hil、iac、org、sip、sop、spa等）和SPI-2（ssa、ssc、sse、ssp等）毒力岛。内毒素相关毒力基因均有29个;参与铁合成、运输、摄取作用的基因均有18个。ARGD预测的耐药基因S19菌株有38个,C46菌株有37个;CRDB对近年来新出现的耐药基因的预测结果发现S19株有173个耐药基因,C46有171个耐药基因;CRDB和ARGD预测到的耐药基因中,两株分离菌均对氨基糖苷类、β-内酰胺类及磺胺类有较多数量的耐药基因,且两株菌中均存在多种抗菌药物的耐药基因;从测序的2株沙门菌基因序列分析得出,耐药基因与耐药表型基本相符。