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稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）,又名苞叶虫、刮青虫等,属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae昆虫,是水稻三大螟虫中最具破坏性的一种害虫,每年给水稻生产带来大量损失,严重威胁到水稻种植业的发展。几丁质（Chitin）又称甲壳素,是昆虫多个重要组织器官的组成成分之一,在昆虫的体壁、表皮和食围膜、中肠等组织的发育过程中起着至关重要的作用,海藻糖是昆虫几丁质合成通路的起点,经过8个关键酶的催化反应,最终生成几丁质。昆虫乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP）和6-磷酸果糖谷氨酰转氨酶（GFAT）分别是昆虫几丁质合成通路上的第4和第7种酶,这两种酶分别调控几丁质合成的两个关键亚反应,在昆虫几丁质的合成中起重要的作用,是治理这种害虫潜在的理想靶标。RNA干扰（RNAi）已经被广泛应用于昆虫基因功能和害虫防治的研究。本论文以稻纵卷叶螟为研究对象,克隆了稻纵卷叶螟乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因（CmUAP）和6-磷酸果糖谷氨酰转氨酶基因（CmGFAT）,对这两个基因做了全面的特征分析及表达模式分析,并以这两个基因为靶标,体外合成双链RNA（dsRNA）,使用显微注射技术向三龄幼虫体内注射dsRNA,降低目标基因的表达量,探究这两个基因在稻纵卷叶螟生长发育中的重要作用。1.CmGFAT基因的克隆及表达分析GFAT在昆虫氨基己糖的生物合成途径（Hexosamine biosynthetic pathway,HBP）中起着重要的调节作用,它将糖酵解途径中的果糖6-磷酸酯与谷氨酰胺结合起来产生6-磷酸氨基葡萄糖,是昆虫几丁质合成通路上一种十分重要的限速酶。本研究以稻纵卷叶螟为研究对象,采用RT-PCR结合RACE-PCR的方式克隆了CmGFAT基因的cDNA序列,并在此基础上利用多种软件对该基因和其编码的蛋白进行了一系列生物信息学分析,结果显示CmGFAT的cDNA全长2117bp,含有长度为2025bp的开放阅读框,编码674个氨基酸。同源性和系统发育分析表明CmGFAT与黄野螟Heortia vitessoides、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis、脐橙螟Amyelois transitella氨基酸相似性较高,分别达到97%、95%、95%。与多种已发表的鳞翅目昆虫谷氨酰胺6-磷酸果糖转氨酶基因序列一致性高达70%以上。同源建模表明,CmGFAT的三维分子结构包含18个α螺旋、19个β折叠片和40个无规则卷曲。dd PCR结果表明,CmGFAT在稻纵卷叶螟的所有发育阶段和成虫的12个组织中都有表达,在低龄幼虫阶段表达量呈逐渐上升趋势,在成虫中的表达量显著高于幼虫,在成虫的中肠和体壁中表达量最高,在头部、翅等组织中表达量较低。2.CmUAP基因的克隆及表达分析UAP是昆虫几丁质生物合成通路上一个重要的限速酶,本研究以稻纵卷叶螟转录组数据为基础,采用RT-PCR和RACE-PCR结合的方式克隆了稻纵卷叶螟CmUAP基因,并对其进行了生物信息学分析和时空表达模式的测定。结果显示CmUAP的cDNA全长1788bp,含有1464bp的开放阅读框,编码487个氨基酸。同源性和聚类分析显示,CmUAP与桑螟Glyphodes pyloalis,亚洲玉米螟O.furnacalis和黄野螟H.vitessoides的UAPs分别具有高达91.79%、87.89%和82.75%的同源性。同源建模表明,CmUAP的三维分子结构形成了一个包含37个α螺旋、37个β折叠片和71个无规则卷曲的二聚体结构。利用微滴式数字PCR技术（dd PCR）测定CmUAP基因的表达模式,结果表明:CmUAP在稻纵卷叶螟生活史的所有8个发育阶段和成虫的12个组织中均有表达,在成虫阶段的表达水平显著高于其他发育阶段,在成虫的中肠、表皮、体壁中具有较高的表达水平。3.注射dsRNA沉默稻纵卷叶螟CmGFAT基因通过体外合成dsRNA,采用显微注射的方式定向沉默稻纵卷叶螟的CmGFAT基因,显著降低了该基因的表达,干扰效率最高达59%,导致了稻纵卷叶螟蜕皮异常,体色受到影响,死亡率升高,进食和活动减少。证实了CmGFAT基因稻纵卷叶螟的生长发育至关重要,为通过RNAi技术靶向CmGFAT基因防治这种昆虫奠定了理论基础。4.注射dsRNA沉默稻纵卷叶螟CmUAP基因通过体外合成dsRNA,采用显微注射的方式定向沉默稻纵卷叶螟的CmUAP基因,探究CmUAP基因在稻纵卷叶螟生长发育过程中的功能和作用。人工合成了2ug/ul的高质量的dsRNA,并成功注射到稻纵卷叶螟3龄幼虫中,靶向沉默了CmUAP基因的表达,RNAi效率高达68.6%,导致了稻纵卷叶螟的校正死亡率升高到对照组的3倍、生长缓慢、活动较少和排泄减少、体重减轻、发育畸形等一系列严重的发育障碍,证实了CmUAP基因稻纵卷叶螟的生长发育至关重要,靶向沉默CmUAP基因会导致稻纵卷叶螟发育障碍和死亡,为通过RNAi技术靶向沉默CmUAP基因防治这种昆虫奠定了理论基础。