研究背景基因拷贝数变异(copy number variation,CNV)是指人类基因组DNA片段大小范围从kb到Mb的亚微观突变,主要表现为缺失或重复。CNV的形成机制主要包括DNA重组与DNA错误复制两大类。DNA重组主要包括非等位同源重组和非同源末端连接。非等位同源重组是不同基因组位置的同源序列交换导致的,主要发生在减数分裂过程中;与非等位同源重组不同的是,非同源末端连接不需要同源序列作为底物,并且可以在连接部位插入碱基。DNA错误复制发生在DNA复制叉停滞时,滞后链从一个复制叉上脱落,通过同源序列转移到另一个空间位置上接近的复制叉。CNV是基因组结构变异(structura1 variation,SV)的重要组成部分,广泛存在正常人类基因组中,是人类遗传多样性与个体间遗传差异的一个重要原因,除了构成遗传多态性外,它还是人类疾病的重要致病因素之一。研究发现,CNV可以导致孟德尔遗传的单基因疾病、罕见疾病,也与复杂疾病相关,其可能通过影响基因的表达量、改变基因产物的结构和位置效应等机制参与疾病的发生和发展,是一种可能具有致病性、良性或未知临床意义的基因组改变。由CNV所导致的常见疾病有我国南方两广地区高发的α-地中海贫血、唐氏综合症、猫叫综合症、自闭症、脊髓性肌萎缩症等疾病。CNV作为一种参与疾病发生发展的新型基因组结构变异形式,对其进行快速准确的检测在临床上具有非常重要的意义。目前,用来检测CNV的方法有比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridization,aCGH)、荧光原位杂交(customized fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)、新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)和数字化 PCR 分析(digital PCR analysis)等。然而,就目前的研究进展,不管使用哪一种检测方法,都存在优势和局限性,其中费用高和操作繁琐是最大的限制。CNV的检测是疾病相关基因的拷贝数检测,任何一种分子诊断方法的最终目的都是为了确定目的基因的缺失或重复情况。本研究的目的是建立一种快速准确简单高通量低成本检测CNV的新途径新方法,有效解决目前检测方法存在的局限性。研究方法根据CNV致病的分子基础,只要能准确分析疾病相关基因的缺失或重复情况,就能准确诊断疾病。近些年来,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)因其快速高通量、无后续处理不存在污染等优点被广泛应用于临床检测,该方法也用于CNV检测。根据PCR扩增公式:Xn=X0*(1+Ex)”,当扩增效率(Ex)为100%,初始模板拷贝数(X0)为1时,达到目的拷贝数(Xn)8,所需要的循环数(8=1*2n)为3;当初始模板拷贝数(X0)为2时,达到目的拷贝数(Xn)8,所需要的循环数(8=2*2n)为2;当初始模板拷贝数(X0)为3时,达到目的拷贝数(Xn)8,所需要的循环数(8=3*2n)为1.42。这样,理论上来说,3拷贝与1拷贝(拷贝数差异为3倍)的定量检测Ct值差异有1.58;2拷贝与1拷贝(拷贝数差异为2倍)的定量检测Ct值差异有1;而3拷贝与2拷贝(拷贝数差异为1.5倍)的定量检测Ct值差异只有0.58。由此可见,这种传统的荧光定量PCR方法对于拷贝数差异倍数较小,如1.5倍差异的CNV并不能得到清晰准确的检测结果,容易导致假阴性。为解决这样的技术瓶颈,我们首次提出建立“原始模板封闭荧光定量PCR快速定量拷贝数”的检测方法。根据此方法学研究策略,具体实施了以下研究方案与方法。1.进行原始模板封闭处理。假设某一特定目的片段于正常样本中存在4个拷贝,而于待检样本中存在6个拷贝,那么待检样本与正常样本(对照样本)的原始拷贝数比值为1.5倍,通过传统实时荧光定量PCR检测,只获得0.58个Ct值的差异,该微小差异并不能清晰反应样本间存在的差异。如果待检样本和对照样本中各有2个拷贝被封闭住不做为模板进行后续的PCR扩增,那么这两个样本中的拷贝数将分别为4(6-2)和2(4-2),即原始拷贝数比值转化为2.0倍,通过实时荧光定量PCR检测,可获得1个Ct值的差异,该差异可以清晰反应样本间存在的差异。基于这样的实验设想,我们首次提出“封闭原始模板”的处理,该处理的原理是:在代表性DNA片段内,分别设计覆盖上下游引物结合区域的寡核苷酸序列,并于寡核苷酸序列的3’端加入1-3个与模板非互补的碱基,并且在寡核苷酸序列的3’端进行spacer C3修饰。这种经过人工修饰的寡核苷酸序列,我们将其定义为“封闭探针”,在PCR扩增反应过程中,封闭探针通过互补序列与检测模板结合,但因为3’端碱基与模板序列不匹配,以及spacerC3的修饰作用阻止Taq酶5’-3’DNA聚合酶活性,使其不能够进行延伸。2.建立三重荧光定量PCR体系。本研究以21号染色体三体综合症,即唐氏综合症为疾病模型,该病患者的基因型与正常基因型相比,拷贝数变异为1.5倍。选择唐氏综合症关键区域相关基因DSCR3、DSCR4为目的基因,管家基因GAPDH为内参基因,采用ACt值相对定量方式,同时分析目的基因DSCRJ、DSCR4的相对拷贝数。实时荧光定量PCR技术利用指数增长期的Ct值计算模板的相对原始拷贝数,原始拷贝数越多,Ct值越低。对于一正常样本,DSCR3、DSCR4与GAPDH的拷贝数相等,Ct值的差异(△Ct)恒定;如果待检样本为唐氏综合症患者,其唐氏综合症关键区域相关基因,如DSCR3、DSCR4拷贝数增加而Ct值减低,则与GAPDH的△Ct值也将增大。从理论及数据分析原理上,可根据相对定量方式准确分析目的基因的重复情况以达到疾病的诊断目的。所采用的ACt值相对定量方式,是基于固定体积和固定浓度gDNA标本中,目的基因和内参基因拷贝数的比例。为消除单独分管检测时,由于各管加入模板量的差异而导致的Ct值误差,本研究建立三重实时荧光定量PCR体系,在相同模板量、相同扩增条件下同时检测目的基因和内参基因。为保证三重荧光定量PCR体系的高特异性及高扩增效率,采用“模板预扩增”处理,即先以低退火温度合成检测模板,再以高退火温度进行检测的处理。3.原始模板封闭荧光定量PCR体系全面优化。参照相关文献,必须保证目的基因和内参基因的扩增效率高且基本一致,才能应用2-△△Ct值数据分析方法。在验证了 DSCR3、DSCR4和GAPDH引物及TaqMan探针的特异性后,对该体系的引物浓度、TaqMan探针浓度、PCRBuffer浓度、Mg2+浓度、检测模板量、封闭探针浓度等体系组分及循环数、退火温度、延伸时间等反应条件,进行一系列的优化与调整。通过体系的综合扩增效率分析和各PCR反应的扩增效率一致性评价,确定原始模板封闭荧光定量PCR优化体系。4.原始模板封闭荧光定量PCR体系分析。遗传病的实验室诊断方法,是建立一定的检测体系达到检测的目的,故诊断方法的建立,检测体系的优化是前提,准确性是关键,敏感性和重复性是应用的保证。我们所建立的原始模板封闭荧光定量PCR检测体系,能否达到大规模人群筛查及常规分子诊断的预期目标,需进一步分析,包括准确性、敏感性和重复性分析。5.原始模板封闭荧光定量PCR体系样本盲法分析。准备了 139例浓度大于100ng/ul、OD260/280于1.7-1.9、经过核型分析确定基因型,包括正常基因型和21三体综合症三体型的临床gDNA样本,对其盲法编号后,应用原始模板封闭荧光定量PCR优化体系进行检测分析,将检测结果汇总,与核型分析判断的结果进行对比。6.原始模板封闭荧光定量PCR体系分辨能力探讨。为探讨原始模板封闭荧光定量PCR体系的分辨能力,我们将该优化体系应用于21三体综合症嵌合型临床样本的检测。检测嵌合比例分别为0%,10%,20%,30%,40%,50%,60%的样品。另外,准备了 18例浓度大于100ng/ul、OD260/280于1.7-1.9、经过核型分析确定基因型,包括正常基因型和21三体综合症嵌合型的gDNA样本,对其盲法编号后,应用原始模板封闭荧光定量PCR优化体系进行检测分析,将检测结果汇总,与核型分析判断的结果进行对比。研究结果根据实验目标及实验策略,通过实施具体实验方案与方法,所获得的实验结果如下:1.建立了原始模板封闭荧光定量PCR体系。该体系中,所选取的目的基因代表性DNA序列及所设计的引物、TaqMan探针,经验证,其特异性可靠;所建立的三重荧光定量PCR反应有效扩增,互不干扰;所采用的先以低退火温度合成检测模板,再以高退火温度进行检测的模板预扩增处理措施切实可行;对原始模板进行封闭处理以改变样本间的原始拷贝数差异切实可行。2.确定了原始模板封闭荧光定量PCR体系。经一系列PCR反应组分及反应条件优化与调整,以及综合扩增效率和各PCR反应扩增效率一致性评价,所确定的优化体系为总反应体积20ul,含1.5x PCR Buffer、5.0mmol/L Mg2+、0.2mmol/LdNTPs、125nmol/L 引物、125nmol/L TaqMan 探针、10nmol/L 封闭探针、lUExTaq酶、±200nggDNA。PCR反应扩增条件为:95℃预变性5min→2cycles(95°C30sec+65℃lmin+52℃30sec)→35cycles(94℃30sec+62℃lmin)。经过优化与调整,建立的原始模板封闭荧光定量PCR体系的扩增效率高且基本一致,基因DSCR3、DSCR4、GAPDH的扩增效率分别为106.0%、107.5%、100.9%,均接近100%;目的基因DSCR3、DSCR4的扩增效率一致性分析曲线的斜率均为0.0002,接近于0。3.原始模板封闭荧光定量PCR体系用于CNV诊断的准确性强、灵敏度高、重复性好。建立的原始模板封闭荧光定量PCR检测方法诊断唐氏综合症样本的准确性达到100%;应用该检测体系,低至7.25ng的gDNA检测量,也能得到理想的检测结果;另外,无论是批内精密度分析还是批间精密度分析,均能得到较均一的检测结果。4.原始模板封闭荧光定量PCR体系实现对CNV的快速分子诊断。本研究以21三体综合症为疾病模型,应用原始模板封闭荧光定量PCR体系对139例临床样本进行盲法分析,检测出39例21三体型样本,与核型分析结果对比,两方法的检测结果完全相符;另外,新诊断方法不仅实现对21三体型的检测,并且能够对嵌合比例达40%的21嵌合型样本进行检测;对于21嵌合型的诊断评价,诊断出8例嵌合体,与核型分析的检测结果相符。研究结论通过本研究,从理论上建立了一种“封闭原始模板”快速改变拷贝数差异倍数的新途径;从方法学研究上,建立了一种原始模板封闭荧光定量PCR诊断CNV的分子诊断新方法。建立的新诊断方法,有效解决了传统荧光定量PCR检测CNV,尤其是拷贝数变异倍数小于2倍的CNV,存在假阴性的技术瓶颈;另外,可通过一次反应,同时完成多个样本的检测,大大减少了工作量、检测成本及检测时间,提高了检测通量和检测效率。通过本研究建立的“原始模板封闭荧光定量PCR”诊断方法,可为其它拷贝数变异遗传病的分子诊断方法学研究提供借鉴与参考。