丝状真菌降解植物细胞壁的分子机制是木质纤维素降解和植物病害防治领域的重要科学问题。丝状真菌中,纤维素酶基因的表达受葡萄糖、蔗糖等简单碳源的阻遏,受纤维素诱导,这一过程主要在转录水平进行调控。植物细胞壁降解酶基因的关键转录调控因子xyr1和clr-2几乎存在于所有腐生丝状真菌中,研究发现,xyr1和clr-2的同源基因在不同的物种中有着不同的调控方式。转录因子xyr1是里氏木霉中最主要的纤维素酶、半纤维素酶调控因子,它的缺失会直接导致里氏木霉不能合成任何木质纤维素降解酶。而在粗糙脉孢霉中,xyr1的同源基因xlr-1却只调控半纤维素酶基因的表达,对纤维素酶系的诱导表达几乎没有任何影响,其纤维素酶系主要由转录因子clr-2进行调控。在粗糙脉孢霉中,clr-2基因的缺失可直接导致其不能在以纤维素为唯一碳源的培养基中生长,而组成型表达clr-2基因后,可使粗糙脉孢霉在以葡萄糖或蔗糖等阻遏条件下诱导表达纤维素酶。通过序列比对分析发现里氏木霉中也存在clr-2的同源基因（基因ID:26163,暂命名为tclr2,数据库:https://mycocosm.jgi.doe.gov/cgi-bin/disp Transcript?db=Trire2&id=26163&use Coords=1）,有研究表明在里氏木霉中过表达clr-2的同源基因tclr2对其纤维素酶半纤维素酶的表达没有产生任何影响。本研究采用分子遗传学手段在里氏木霉和粗糙脉孢霉中系统研究转录因子xyr1和clr-2在两者间的功能作用方式,探讨转录因子跨种间调控的可能性,主要的实验结果如下:1、为研究tclr2在里氏木霉中的表达模式,将里氏木霉Tu6菌株在不同碳源条件下培养,对其tclr2的转录情况进行检测,结果表明里氏木霉tclr2受到葡萄糖阻遏,纤维素诱导,这一结果与粗糙脉孢霉中clr-2基因的表达模式相吻合。里氏木霉与粗糙脉孢霉同属丝状子囊菌,里氏木霉tclr2与粗糙脉孢霉clr-2基因编码蛋白的氨基酸序列相似度达到61.3%,二者都具有典型的转录因子锌指结构,表达都受到葡萄糖阻遏、纤维素诱导,因此里氏木霉tclr2理论上应该与粗糙脉孢霉clr-2有相同或者相似的功能,即tclr2应该可以调控里氏木霉纤维素酶系的表达。为验证这一假设,本文在里氏木霉中构建了tclr2基因的缺失菌株TrΔtclr2,并在纤维素碳源下检测其纤维素酶基因表达情况。结果显示,里氏木霉中tclr2的敲除对其纤维素酶系的表达没有产生明显影响,进一步对里氏木霉中主要的纤维素酶基因cbh1、cbh2的转录水平进行检测,发现与出发株相比,TrΔtclr2菌株中cbh1、cbh2基因的转录水平也没有发生显著变化。这些结果表明尽管里氏木霉tclr2与粗糙脉孢霉clr-2在序列和表达模式上有很大的相似性,但其功能却完全不同。2、由以上结果得知里氏木霉tclr2无法调控其纤维素酶基因的表达,究其原因可能是:（1）里氏木霉TCLR2蛋白在进化中失去转录因子活性;（2）里氏木霉纤维素酶基因启动子序列在在进化过程中失去了TCLR2蛋白的结合基序,不能与之发生有效结合。为阐明里氏木霉tclr2无法调控纤维素酶基因的原因,本文在clr-2缺失的粗糙脉孢霉突变株中组成型表达里氏木霉tclr2,检测里氏木霉tclr2在粗糙脉孢霉中的异源表达是否可互补其自身clr-2基因的缺失表型。实验结果显示,重组菌株在蔗糖唯一碳源条件下几乎不能分泌任何蛋白,纤维素酶基因cbh1、cbh2在此条件下也没有发生转录。在纤维素唯一碳源条件下重组菌株不能生长,这表明重组菌株中里氏木霉的tclr2基因并不能互补粗糙脉孢霉clr-2的基因功能,里氏木霉中的tclr2基因可能在进化过程中失去了转录因子功能。3、为进一步研究有功能的粗糙脉孢霉CLR2蛋白能否在里氏木霉中调控纤维素酶基因的表达,本文在里氏木霉中以组成型表达的粗糙脉孢霉有功能的clr-2基因替换其tclr2基因。葡萄糖碳源下检测其是否可以像在粗糙脉孢霉中一样介导纤维素酶基因在阻遏条件下的表达。同时,在xyr1缺失的里氏木霉菌株Δxyr1中异源表达粗糙脉孢霉的clr-2基因,检测其是否可在纤维素碳源下互补xyr1的基因功能。实验结果显示,在里氏木霉中异源表达粗糙脉孢霉的clr-2基因并不能使其纤维素酶基因得到表达。这一结果说明粗糙脉孢霉的clr-2基因并不能跨种间调控里氏木霉的纤维素酶基因,原因可能是里氏木霉纤维素酶基因启动子没有其结合基序。为了验证这一假设,在粗糙脉孢霉的clr-2基因异源组成型表达的里氏木霉菌株中,进一步将里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的启动子序列替换为粗糙脉孢霉的cbh1启动子序列,检测葡萄糖碳源下是否可实现CBH1单一纤维素酶的表达。实验结果显示,新构建的重组菌株在葡萄糖唯一碳源条件下能够分泌微弱的CBH1蛋白,这说明粗糙脉孢霉clr-2基因可以在里氏木霉中与其自身cbh1启动子互作,调控下游基因的表达。4、为研究里氏木霉xyr1基因是否能够实现跨种间调控粗糙脉孢霉的木质纤维素降解酶基因的表达,在clr-2缺失的粗糙脉孢霉菌株Δclr-2中组成型表达里氏木霉xyr1,检测其是否可互补clr-2基因的功能,实验结果显示,在蔗糖唯一碳源条件下,重组菌株几乎不能分泌任何蛋白;在纤维素为唯一碳源条件下,重组菌株不能生长,这些结果表明与clr2类似,xyr1基因也不能在二者之间实现跨种间调控。综上,尽管粗糙脉孢霉和里氏木霉在进化关系上非常接近,在自然生境中都可降解木质纤维素,但其木质纤维素降解酶基因的表达调控方式却有很大的差别。关键的转录调控因子clr-2和xyr1虽然在二者中都存在,而且其序列和表达模式上也有很多相似性,但其功能却发生了很大变化,并不能在这两种物种中实现跨种间调控。