论文部分内容阅读
目的： 血管通透性增高是休克时有效血容量减少和器官功能损伤的重要原因之一，它的防治一直是医学界的一大难题，对于大面积烧伤，中毒性休克，ARDS等患者临床上只能被动使用补液和抗感染等方法来控制病情的发展，而不能针对血管通透性增高的机制予以干预。正常生理情况下，构成血管内壁的内皮细胞处于一种半通透状态，形成血管和组织间物质交换的结构和功能屏障。在损伤因子(如炎症、外伤)刺激下，内皮细胞损伤或细胞间隙的开放都可以使屏障功能发生障碍，最终引起血管通透性增加，水肿形成。大量革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)在生长繁殖或死亡菌体裂解时释放内毒素(endotoxin)，其主要成分是细菌细胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是造成过G~-菌浓毒症和感染性休克的主要因素。它可通过与特异性细胞受体的结合激活体内的单核/巨噬细胞系统、多形核白细胞(PMN)、淋巴细胞等多种细胞，释放炎症介质和一些酶类物质如TNF-α、IL-1、IL-6、PAF、ICAM-1和LDH等，这些细胞因子与LPS一起激活和损伤血管内皮细胞，导致血管通透性升高。LPS也可以通过直接识别内皮细胞相应受体如TLR4(tolllike receptor4)，从而激活细胞内相应的蛋白激酶和离子通道，启动细胞内信号转导，磷酸化有关蛋白，引起转录因子NF-kB的激活和编码各种细胞因子、受体分子的靶基因的转录，完成信息从细胞外向细胞内的传递，最终导致内皮细胞骨架蛋白收缩重组，细胞与细胞和细胞与基底膜间的黏附连接松解，缝隙形成，血管通透性增加。许多实验证明内皮细胞骨架蛋白之一肌动蛋白(actin)，内皮细胞钙黏附素(vascular endothelial cadherin VE-cadherin)以及连环素(catenin)在血管通透性调节中发挥了重要的作用。另外细胞内钙离子和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作为第二信使在血管通透性变化中也扮演了重要的角色。本文研究的目的之一，是观察LPS直接作用于内皮细胞对细胞骨架肌动蛋白结构和功能的影响，探讨LPS作用的浓度和时间效应，以及LPS作用下F-actin和G-actin相互转化的关系。本研究的第二个目的，是观察LPS直接作用于内皮细胞后对VE一cadherin结构和功能的变化，探讨LPS作用的浓度和时间效应。本研究的第三个目的，是观察LPS作用后内皮细胞内游离钙离子浓度([C扩+1i)的变化及其与细胞骨架和细胞收缩的关系。本研究还观察了烧伤大鼠血清和游离的多型核白细胞(PMN)刺激内皮细胞对内皮细胞骨架的影响，进一步从细胞骨架角度阐述烧伤休克引起的微血管通透性升高的机制。实验材料及方法: 本研究选用人脐静脉内皮细胞株ECV一304作为主要研究对象，以LPs、烧伤大鼠PMN和烧伤大鼠血清为主要刺激物。 1.内皮细胞actin的染色:F一actin的染色:生长于微孔小皿的ECV一304近单层或铺满单层时，给予相应刺激后，PBS漂洗，先用2%的多聚甲醛、0.5%TritonX一100混合PBS液进行固定和膜打孔20 min，PBS漂洗3次，罗丹明标记的F一actin特异性结合物鬼笔环肤 (Rhodamine一phalloidin，2口ml)染色40 min，PBs洗3次。o一actin的染色步骤与F一actin相似，G一actin特异性结合物为俄勒冈绿标记的DNA酶I(oregon Green一DNasel，0.6林mol/L)。最后用Ni灿n TE300荧光倒置显微镜镜检，Kodak 200胶卷照相。 2.内皮细胞actin的定量观察:利用流式细胞仪技术分别定量检测不同浓度和不同时相的LPS刺激下的内皮细胞F一actin和G一actin含量的变化。 3.内皮细胞vE一c adherin的免疫荧光染色和观察:生长于微孔小皿的ECV一304铺满单层，给予相应刺激后，冷PBS液漂洗，2%多聚甲醛固定20 min，0.2%Titon一xl00膜打孔10min，2%兔血清封闭lh后PBs洗3次。后加vE一e a d h e r in一抗(1:1 00)4 oC Zh，PBs洗3次，2%山羊血清封闭lh后PBS洗3次。加荧光二抗(R a b b it一A n ti-Goat一FITC，l:200)4oC孵育lh，PBS洗3次共10min(避光)。 4.以Fura一3/AM作为c扩+的荧光指示剂，以485nln为激发波长，52Onln为发射波长，利用激光共聚焦技术，观察不同浓度的LPS作用下细胞内游离钙离子浓度的动态变化。 结果用Mean士sD表示，用sPssn.o软件进行one-A way~ANOVA分析，P<0.05差异有显著性有意义，P<0.01有非常显著性差异。结果: 1.LPS直接作用于内皮细胞对细胞骨架肌动蛋白结构和功能的影响: 正常对照组的内皮细胞F一actin主要分布在细胞周边和核的周围:而G一actin主要分布在细胞核区域。低浓度的LPS(10ng/ml)直接刺激6h后F一aetin发生重组，部分细胞出现应力纤维(Stress fibers);大于100 ng/ml时可以看到细胞轮廓变圆，纤维丝变短变粗;部分细胞出现丝状尾足 (filopodia)和板状尾足(lamellipodia)，当LpS大于500 ng/ml时上述现象更为明显;100Ong/m1的LPS刺激30 min细胞骨架即可出现重组，应力纤维最早出现，随着时间的延长，上述变化更为明显，有的细胞出现微丝溶解现象(eloud of fluoreseent material)。LPS作用于内皮细胞后，G一actin的变化表现为发生细胞内移位，由正常时集中在细胞核区向细?