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翼首草总皂苷(Pterocephalus hookeri Total Saponins,PHTS)是从匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck根部提取的有效部位。PHTS抗肿瘤活性国内外未见报道,本课题组采用体内和体外相结合的方法,从整体和细胞水平研究了PHTS抗肿瘤作用,并进行了初步的机制探讨。
目的:探讨PHTS抗肿瘤作用,并初步揭示其作用机制,为进一步研究奠定前期基础。
方法：1.通过大孔树脂对翼首草根80％乙醇提取物进行分离、纯化,获得PHTS。
2.在体外,采用MTT比色法测定PHTS对人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901等6种肿瘤细胞的增殖抑制作用;通过形态学观察、经AnnexinV-FITC/PI双染,流式细胞仪检测PHTS对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响。
3.在体内,进行了PHTS急性毒性研究,观察了小鼠的死亡情况及其中毒反应;考察了PHTS对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响及对小鼠免疫器官的影响,从整体水平考察PHTS的抗肿瘤活性。
结果：1.通过大孔树脂纯化法成功制备了得率依次为8.57％、8.22％、8.35％,纯度依次为73.82％、79.68％、74.61％的三批PHTS。该方法稳定、可行,可用于PHTS的制备。
2.PHTS在(0.3～30 μg/ml or 1～100 μg/ml)的浓度范围内,对人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901等6种肿瘤细胞的增殖均有不同程度的抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)均在15μg/ml以下,尤其对人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖抑制效果最为显著,其IC50为0.81μg/ml;时量曲线检测结果显示:PHTS对人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用具有良好的时-量-效依赖关系。
3.倒置相差显微镜下观察发现:PHTS在0.3～30 μg/ml的浓度范围内作用于人肝癌细胞株SMMC-772148 h后,均不同程度的出现细胞数量减少,透光性减弱,贴壁性丧失,细胞形态变圆,体积缩小,细胞膜边缘模糊,细胞核固缩、密度增加等细胞凋亡的特征性变化;荧光显微镜下观察发现:均不同程度出现强烈荧光,凋亡小体,胞浆浓缩深染等凋亡形态学变化;流式细胞仪(FCM)检测发现:不同浓度的PHTS作用细胞24 h后的凋亡率依次为0.66％、0.99％、2.53％、4.84％,明显高于阴性对照组(0.60％),作用48 h后的凋亡率依次为4.30％、5.23％、12.02％、16.64％、亦高于阴性对照组(1.39％),表明PHTS确有诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用,且具有良好的时-量-效依赖关系。
4.PHTS小鼠灌胃最大给药量为:生药119.33g/kg体重,折合计算,相当50 kg成人5 g日用量的1193.32倍:体内抑唐实验发现:PHTS各剂量组(0.625 g/kg、1.25g/kg、2.5g/kg,1d～10d)对S180荷瘤小鼠的抑瘤率分别为41.60％、60.86％、43.45％,PHTS各剂量组的瘤重与阴性对照组比较减少,且具有显著性差异(P均＜0.01);PHTS中、低剂量组的胸腺指数与阴性对照组比较降低,但无显著性差异(P均＞0.05),但与5-Fu组比较升高,亦具有显著性差异(P均＜0.05);PHTS中剂量组脾脏指数与阴性对照组比较减少,且具有显著性差异(P均＜0.05),PHTS中、低剂量组脾脏指数与5-Fu组比较升高,均具有显著性差异(P均＜0.05)。
结论：PHTS对体外培养的6种人肿瘤细胞株的增殖具有显著抑制作用,且具有明显的量-效依赖关系;PHTS能诱导SMMC-7721细胞的凋亡,其抑瘤效应可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关;急性毒性研究表明,PHTS小鼠灌胃最大给药量为50 kg成人日用量的1193.32倍,因此是安全的;PHTS对S180荷瘤小鼠的肿瘤生长具有较好的抑制作用;对S180荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保护作用。PHTS作为一个安全有效的抗肿瘤中药提取物,值得进一步研究。