烟色烟管菌菌丝体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究

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烟色烟管菌(Bjerkandera fumosa)属于担子菌门(Basidiomycota)、多孔菌科(Polyporaceae)、烟管菌属(Bjerkandera)的药用真菌,为一年生白腐真菌。野生烟色烟管菌的子实体提取物在东北民间被认为具有生物活性,如免疫调节和抗肿瘤(尤其是抗子宫癌)等。但到目前为止,还没有对烟色烟管菌子实体成分及功能的相关研究。近年来随着自然条件的破坏,野生真菌资源越来越匮乏,限制了药用真菌的开发和利用;而液体发酵法具有菌丝体产量高、培养周期短、易于控制、污染少等特点,是大量制备菌丝体及其活性物质的有效途径。本论文在此背景下,对烟色烟管菌的液体发酵培养基进行优化,并对烟色烟管菌的菌丝体多糖进行了分离纯化、理化性质、结构分析和生物活性的研究,以期发现具有高活性的菌丝体多糖均一组分,为进一步开发该菌的药物提供初步研究和理论基础。本论文主要的研究内容及结果如下:(1)烟色烟管菌液体发酵培养基的优化以菌丝体产量为指标,用单因素法、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和Box-Behnken响应面实验,对烟色烟管菌的液体发酵培养基进行了优化,确定了最优发酵培养基为(g/L):玉米粉60,豆饼粉2,K2HPO4 1.5,KH2PO4 0.75,MgSO40.05,FeSO4 0.005,CuSO4 0.002,ZnSO4 0.001,CoCl2 0.0036,MnSO4 0.004,在此条件下,菌丝体产量高达19.303 g/L,是基础培养基菌丝体产量的7.114倍。(2)烟色烟管菌菌丝体多糖的分离纯化通过发酵培养获得烟色烟管菌菌丝体,将菌丝体依次经热水提取、醇沉、酶-Sevag法去蛋白,制备去蛋白多糖,命名为DBFM,为浅褐色粉末,且易溶于水。用DEAE-32纤维素阴离子交换层析对去蛋白多糖DBFM进行初步分离,得到中性多糖DBFN及酸性多糖DBFA1和DBFA2,再用Sepharose CL-6B凝胶层析对DBFN、DBFA1和DBFA2进行进一步纯化,得到DBFM1、DBFM2和DBFM3。用高效液相凝胶渗透色谱(HPGLC)对DBFM1、DBFM2和DBFM3进行纯度检测,结果表明仅DBFM3为均一多糖组分,因此将DBFM3作为下一步的研究对象。(3)多糖DBFM3的理化性质及结构分析用HPGLC、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法和间羟联苯法分别测定DBFM3的分子量、总糖含量、蛋白质含量和糖醛酸含量,结果显示其分子量为1.8×105 Da、总糖含量为57.64%、蛋白含量为1.758%、糖醛酸含量为7.29%。用高效液相色谱(HPLC)测定了DBFM3的单糖组成,结果显示DBFM3由甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖组成,摩尔比为1:18.16:0.702;用紫外光谱(UV)检测出DBFM3含有少量蛋白质成分;DBFM3的红外光谱(FT-IR)和核磁共振(NMR)分析表明:该多糖的糖环形式为吡喃糖环,糖苷键构型为β型,可能含有1→3、1→3,6及1→6糖苷键。(4)烟色烟管菌菌丝体多糖的生物活性研究体外抗氧化实验发现,去蛋白多糖DBFM及其纯化组分DBFM3能够清除DPPH自由基、羟自由基,且存在剂量效应,且DBFM3的清除率高于DBFM;DBFM3对H2O2诱导的DNA损伤具有保护作用,减少了羟基自由基对质粒DNA的损伤;DBFM和DBFM3对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,能够提高细胞存活率,且DBFM3的活性较未纯化多糖DBFM高。用体外脾淋巴细胞模型研究了去蛋白多糖DBFM及其纯化组分DBFM3的免疫活性,结果表明DBFM和DBFM3对脾淋巴细胞的增殖具有促进作用,同时对ConA/LPS诱导的T/B淋巴细胞增殖具有定协同作用,且DBFM3的活性较未纯化多糖DBFM高。
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