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背景与目的:近年来,氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)在工业领域得到大量使用,其他应用领域还包括临床疾病治疗、诊断、药品递送的新型载体等。由于GO材料的大量使用,其释放到环境中也对人类和水中生物的健康构成潜在威胁。纳米材料的大小显著影响许多细胞参数,如氧化应激、免疫应答和细胞活力等环节。GO的尺寸大小与表面氧化可能影响其在不同模型上的性质和相关毒性。因此,确定不同粒径大小的GO之间关系及对各种生物的毒性影响程度至关重要。与其它脊椎动物模型相比,斑马鱼与人类基因组有很高的相似性,因此相关研究结果可以外推到人类;斑马鱼对水体污染更为敏感,并且具有生长周期短,成本低等优点。本研究采用斑马鱼为实验对象,评估不同粒径大小的GO(小尺径为50-200 nm,S-GO;中尺径为<500 nm,M-GO;大尺径为>500 nm,L-GO)对斑马鱼胚胎发育、游泳行为等的影响及对心脏的毒性效应。方法:将受精4小时后(4 hpf)的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度(0、0.1、1、10、100 mg/L)的三种粒径GO溶液至120小时,在相应时间点记录实验并观察斑马鱼的形态变化。在暴露至48 h和120 h时,记录斑马鱼的生存率;在48 h、54 h、72h和120 h,分别记录斑马鱼的孵化率;暴露至96 h时,对斑马鱼心率进行测量;暴露至120h时,对斑马鱼体长、血流及游泳行为进行记录。在暴露至120 h时,利用带有红色荧光巨噬细胞的转基因AB系斑马鱼(lyz:Ds Red,AB系)检测斑马鱼尾部感兴趣区巨噬细胞数的变化情况。同时将暴露至120 h的斑马鱼(AB系)胚胎收集,检测生化指标一氧化氮合酶(i NOS),乙酰胆碱酯酶(ACh E),总超氧化物歧化酶(T-SOD)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的变化,并利用实时荧光定量PCR测定凋亡基因caspase-3、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)和bax的基因表达,以及与心脏发育相关基因中的β-连环蛋白(β-catenin)、T盒6(tbx6)和T盒16(tbx16)的m RNA表达。结果:(1)三种粒径大小的GO均聚集到斑马鱼的眼睛、心脏、卵黄囊以及尾部血液。诱导斑马鱼的发育毒性,斑马鱼胚胎出现不同程度的畸形,主要有心包水肿、卵黄囊水肿,尾部弯曲等,且随着浓度增高,表现出的畸形率也越高。GO浓度为100 mg/L时,在胚胎发育早期(48 h),S-GO胚胎孵化率受到抑制(P<0.05);M-GO和L-GO分别在浓度为0.1和10 mg/L时,胚胎孵化率显著降低(P<0.05)。高浓度(100 mg/L)暴露至48和120 h,S-GO和L-GO处理组斑马鱼生存率均显著下降(P<0.05),M-GO组仅在120 h明显降低(P<0.05)。高浓度(100 mg/L)暴露至120 h,三种粒径大小的GO均能极显著抑制幼鱼的体长(P<0.001)。(2)三种粒径大小的GO溶液在低浓度下(0.1与1 mg/L)诱导M-GO和L-GO组斑马鱼心率先上升(P<0.05或P<0.001),高浓度下(100 mg/L)三种粒径大小的GO组心率下降(P<0.05或P<0.001)和血流量下降(P<0.05或P<0.01),且诱导心脏发育相关基因的异常表达,在高浓度(100 mg/L)暴露下,S-GO和M-GO组β-catenin和tbx6基因表达均显著上升(P<0.05或P<0.01),M-GO和L-GO组tbx6表达上调(P<0.05)。(3)GO促进凋亡相关基因的表达,其中在高浓度(100 mg/L)暴露下,S-GO组的caspase-3、caspase-9、bax及bcl-2基因表达均明显上升(P<0.05或P<0.01);M-GO组caspase-3、bax和bcl-2表达显著上调(P<0.05);L-GO组bax和bcl-2表达上调(P<0.05或P<0.01)。同时促进凋亡蛋白酶caspase-3的升高(P<0.05或P<0.01)。(4)GO诱导斑马鱼巨噬细胞数量与炎症因子i NOS酶活性增加,其中高浓度(100mg/L)暴露下,S-GO、M-GO和L-GO巨噬细胞数均明显增多(P<0.05);在暴露浓度为10 mg/L时,M-GO和L-GO的巨噬细胞数明显增多(P<0.05)。在GO暴露组(0.1-100 mg/L),L-GO中的i NOS酶活性明显上升(P<0.05或P<0.01);在浓度为01-100 mg/L时,S-GO中的i NOS酶活性也显著上升(P<0.05或P<0.01)。(5)斑马鱼游泳行为的检测:a.在可见光实验中,低浓度组(0.1、1和10 mg/L)诱导斑马鱼的活跃度及游泳距离增加,高浓度(100 mg/L)GO处理组幼鱼的活跃度和游泳距离均降低(P<0.01或P<0.001)。b.在斑马鱼游泳速率时间比的测定中,在低浓度组(0.1、1和10 mg/L)中、高速所占时间比例较大,而在高浓度(100mg/L)下低速所占比例较大。c.在光周期明-暗交替实验中,无论黑暗还是光照环境下,S-GO在高浓度(100 mg/L)暴露下活跃性均显著降低(P<0.05);在第一和第三光照阶段,M-GO在高浓度(100 mg/L)暴露下活跃性也显著降低(P<0.05);GO浓度为100 mg/L时,L-GO组在整个光照阶段活跃性均显著下降(P<0.05)。GO处理组在黑暗环境中幼鱼活跃度比光照环境中明显增加;而且在光照环境中,幼鱼活跃度比前一阶段光照期逐渐下降。(6)当GO浓度为100 mg/L时,与M-GO和L-GO相比,S-GO对运动行为,体长和凋亡相关基因表达方面的毒性作用更明显。而低浓度(0.1 mg/L)暴露下,在斑马鱼胚胎孵化率、心率及相关酶蛋白表达方面,M-GO和L-GO比S-GO的毒性作用更大。结论:暴露于不同粒径大小的GO溶液会引起斑马鱼胚胎和幼鱼发育的浓度依赖性毒性。当GO的浓度为100 mg/L时,多数测试终点均发生显著性变化,斑马鱼幼鱼的形态、生理、生化和行为异常的变化。GO暴露可能诱导斑马鱼幼鱼的氧化应激、免疫毒性、神经毒性、心脏毒性和细胞凋亡。本研究表明了GO的综合毒性不仅与粒径大小密切相关,而且与暴露浓度、暴露时间和评估指标密切相关。