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猪流行性腹泻(PED)是一种急性、感染性高的肠道病毒性疾病,对新生猪仔造成很高的死亡率,猪流行性腹泻病毒(PEDV)为其致病原。PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科,α冠状病毒亚科(或属),基因组为单股正义RNA病毒,基因组大小约28 kb。PEDV变异较大,其临床症状、病理变化以及流行特点都与传染性胃肠炎和轮状病毒病的十分相似。目前,PED在世界范围内广泛流行,但还没有很好的预防和诊断方法。为此本研究选择PEDV S基因的保守序列进行原核表达,制备相应抗体,并初步建立一套检测PEDV抗体的间接ELISA方法。具体研究内容如下:1 PEDV部分S基因的合成及重组质粒的构建通过DNAstar软件对猪流行性腹泻病毒流行毒株S基因进行序列比对与分析,选取位于502-641氨基酸位置处的S1蛋白保守序列,利用大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化,Overlap PCR合成,获得417 bp基因片段,连接到克隆载体pJET/1.2-blunt上,并构建重组表达质粒pET32a-S417和pXXGST-S417。2重组质粒的表达与纯化将获得的重组表达质粒转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,并通过割胶纯化,获得重组蛋白GST-S417,分子量31 kD左右,浓度0.3 mg/mL左右,纯度达95%以上;通过过柱纯化,获得重组蛋白His-S417,分子量30 kD左右,浓度0.1 mg/mL左右,纯度达90%以上。3多克隆抗体的制备以纯化的GST-S417重组蛋白作为免疫原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,免疫量500μg/只。以纯化的His-S417重组蛋白作为包被抗原,检测免疫血清中抗体的效价,ELISA检测结果表明血清效价达1:10000以上,而且制备的多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。该研究表明所选的S蛋白区域具有一定的抗原性。4间接ELISA检测方法的初步建立包被纯化的GST-S417蛋白,摸索最佳间接ELISA条件,结果显示:包被量0.32μg/孔,血清最佳稀释比1:800,HRP标记的抗猪抗体稀释比为1:3000时,检测效果最好,阴性临界值为0.340,有良好的重复性和特异性,与市场销售的诊断试剂盒符合率较高,达72.7%,为进一步开发诊断试剂盒提供了理论和技术基础。