【摘 要】
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背景:随着有机磷农药的广泛使用,农产品中的慢性中毒也已成为人们日益关注的问题。有机磷农药对人体的危害以急性毒性为主,多发生于大剂量或反复接触之后,会出现一系列神经中毒症状,严重者会出现呼吸麻痹,甚至死亡。因此,找到快速检测农药残留的方法对保证食品安全具有重要意义。酶抑制法是目前检测有机磷农药残留的主要技术,具有操作简单,检测速度快的特点,因而适用于现场的快速检测。酶抑制法所用酶包括乙酰胆碱酯酶、丁
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背景:随着有机磷农药的广泛使用,农产品中的慢性中毒也已成为人们日益关注的问题。有机磷农药对人体的危害以急性毒性为主,多发生于大剂量或反复接触之后,会出现一系列神经中毒症状,严重者会出现呼吸麻痹,甚至死亡。因此,找到快速检测农药残留的方法对保证食品安全具有重要意义。酶抑制法是目前检测有机磷农药残留的主要技术,具有操作简单,检测速度快的特点,因而适用于现场的快速检测。酶抑制法所用酶包括乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、动物与植物酯酶,其中乙酰胆碱酯酶对有机磷农药较为敏感,测定的灵敏度高,选择性强,因而被广泛使用。目前,乙酰胆碱酯酶主要从昆虫头部或动物脑组织中提取,其来源相对有限,限制了酶抑制方法的推广。如何选择合适、稳定的酶源则是实现快速、准确检测的关键。目的:在之前的研究中,我们在果蝇乙酰胆碱酯酶（Dm ACh E）的体外重组表达过程中,偶然发现了一株天然剪接基因的突变体,因其来源于黑腹果蝇,所以将该基因命名为Dm ACh E-like。在此之前,Dm ACh E-like并未被报道过。与Dm ACh E相比,Dm ACh E-like具有更小的分子量,便于操作。本研究计划通过对Dm ACh E-like在毕赤酵母中进行表达,比较其与之间的差异,并研究其酶学性质,检测其有机磷农药敏感性,从而为农残检测提供新的酶源。方法:本文通过对Dm ACh E-like进行测序,获得其完整序列。对其序列进行密码子优化,设计相应的引物Dm ACh E-like-up和Dm ACh E-like-down。通过全基因合成,构建含目标基因的载体p UC57-Dm ACh E-like。随后扩增得到目的基因Dm ACh E-like,利用Sna BⅠ和Not I对表达载体p PIC9K进行双酶切,通过无缝克隆构建表达质粒p PIC9K-Dm ACh E-like。利用SalⅠ线性化表达质粒p PIC9K-Dm ACh E-like后通过电击将其转化至毕赤酵母GS115中。通过MD和G418-YPD平板来筛选His+重组转化子,利用菌落PCR验证阳性转化子。对重组表达菌株GS115-p PIC9K-Dm ACh E-like进行1.0%的甲醇诱导表达,通过Ellman法对发酵表达上清进行酶活性测定,TCA沉淀后进行Tricine-SDS-PAGE分析。利用70%硫酸铵对发酵表达上清进行沉淀获得粗酶液。利用粗酶液进行酶学性质以及农药敏感性的初步分析。最后,本实验通过对诱导温度、起始p H以及甲醇诱导浓度三因素三水平的正交试验对发酵条件进行了优化。结果:本研究在4.0 mg/m L G418的YPD平板上筛选到了阳性克隆GS115-p PIC9K-Dm ACh E-like,并成功地在毕赤酵母中表达了Dm ACh E-like,证实了Dm ACh E-like具有乙酰胆碱酯酶活性,发酵上清酶活性为12.32 U/m L。发酵表达上清的Tricine-SDS-PAGE电泳图谱显示在4.3 k Da处有蛋白带。经硫酸铵沉淀初步纯化后,酶活性为76.95 U/m L。酶学性质研究结果表明Dm ACh E-like的最适p H为8.0,且其p H稳定性略优于Dm ACh E。Dm ACh E-like的最适温度为37℃,在温度较高情况下,Dm ACh E-like的稳定性优于Dm ACh E,表现出了良好的热稳定性。此外,农药敏感性实验表明Dm ACh E-like与Dm ACh E两者对农药的敏感性和选择性也存在一定的差异性。Dm ACh E-like对于大多数选定的有机磷农药都表现出了较好的灵敏度。单因素优化和正交试验结果表明诱导温度对于Dm ACh E-like蛋白表达水平的影响比较显著,其次是甲醇诱导浓度,最后才是起始pH。
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