荧光显微成像技术已经成为现代细胞生物学研究过程中一个必不可少的工具。然而，由于衍射现象的存在，传统光学显微镜的分辨率被限制在200纳米（侧向）和500纳米（轴向）左右，远远不能满足生物学研究的需求。近年来，随着各种新型荧光探针和成像理论的出现，研究人员开发出了许多超分辨率成像技术，打破了光学衍射极限，将分辨率推进到了几十个纳米的水平，使亚细胞量级的生物学研究成为现实。尽管取得了巨大的进步，超分辨率成像技术依然面临着许多问题。本文从以下三个方面介绍了超分辨率显微成像技术的改进：第一部分主要介绍了基于单分子干涉的三维超分辨率显微成像系统的搭建（第2章）。研究人员开发了许多方法用于提取荧光分子的轴向位置信息，包括散光成像，双层面成像以及双螺旋点扩散函数成像。尽管如此，超分辨率成像技术的轴向分辨率依然低于其侧向分辨率。为了进一步提高轴向分辨率，研究人员开发了基于双物镜干涉成像的iPALM和4pi-SMS技术。然而，这两种方法过于昂贵，对系统精度要求高，对于非专业人员来说难以实现。目前，还没有别的实验室能够建立这样的系统。有鉴于此，我们设计并搭建了一套比较简单的单分子干涉成像系统。该系统价格适中，光路简单，调节方便，在普通实验室也能够实现。我们介绍了其基本硬件结构和原理，描述了系统的搭建和调试过程，并进行实验成像。结果表明，我们的系统可以达到20~30纳米的三维分辨率。第二部分主要介绍了基于神经网络的单分子定位算法的开发（第3章）。最常用的单分子定位算法是通过非线性最小二乘法或者最大似然估计法对二维高斯函数进行拟合。然而，高斯函数并不是真正的点扩散函数。因此，它不适用于固定角度的荧光分子且会产生几十纳米的系统误差。此外，细胞中的荧光分子具有不同的运动状态。其中大多数荧光分子既不是固定的也不是自由转动的，而是处于一种叫做限制性运动的状态。因此，为了最大限度地提高超分辨率成像的分辨率，有必要针对固定和限制性运动的荧光分子去开发一种快速，高精度，适应性强的定位算法。我们推导出了限制性运动的荧光分子的理论点扩散函数，并以此为基础开发出了一种基于人工神经网络的定位算法，用于估计单分子的位置，角度和运动状态。与传统的拟合算法相比，神经网络算法具有超快的速度，更高的精度，以及较强的鲁棒性和适应性。此外，它还大大降低了图像对离焦情况的敏感性。这些优点使得它成为二维和三维超分辨率图像处理和分析的理想选择。第三部分主要介绍了单体光转化荧光蛋白mEos3的改造（第4章）。超分辨率成像技术的效果很大程度上依赖于光转换荧光蛋白的性质。决定荧光蛋白实际使用价值的因素包括（但不限于）大小，亮度，成熟速率，单体状态，pH敏感性以及光转换之后的光子数。最近，人们发现荧光分子的标记密度限制了所有超分辨率成像技术的有效空间分辨率，而这一点常常被忽略了。mEos2是超分辨率成像技术中最常用的光转换荧光蛋白。然而，我们证实了它在高浓度下有寡聚倾向且在标记膜蛋白时会形成聚集。这表明了它不是一个真正意义上的单体荧光蛋白并限制了它作为融合蛋白的应用。因此，我们解析了mEos2的晶体结构，合理地设计并得到了两个成熟快，亮度、光子数和标记密度都很高的单体荧光蛋白。本文从硬件系统、定位算法、荧光蛋白三个方面对现有的超分辨率成像技术进行了改进和优化。三个部分相互独立又相辅相成，形成一个完整的体系，扩大了超分辨率成像技术的应用范围。